L'ambiente delle vie aeree nei soggetti affetti da malattie muco-ostruttive delle vie aeree (MAD) è caratterizzato da muco disidratato a causa dell'iperassorbimento del liquido di superficie delle vie aeree e di un'alterata clearance mucociliare. Con il progredire delle MAD, il muco patologico diventa sempre più viscoso a causa della sovrapproduzione di mucina e dell'accumulo di DNA extracellulare (eDNA) di origine endogena. Pseudomonas aeruginosa, uno dei principali patogeni delle MAD, colonizza persistentemente questa nicchia mucosa. Nonostante le terapie antibiotiche per via inalatoria e l'assenza di resistenza agli antibiotici, il fallimento del trattamento antipseudomonas rimane una sfida clinica.
Abbiamo utilizzato la visualizzazione dei dati e la modellazione statistica di JMP per studiare come le concentrazioni di mucina ed eDNA – polimeri dominanti nel muco respiratorio – influenzino la tolleranza agli antibiotici di P. aeruginosa, al fine di comprendere la resistenza agli antibiotici. I nostri risultati rivelano che la concentrazione e il peso molecolare dei polimeri influenzano la sopravvivenza di P. aeruginosa dopo l'esposizione agli antibiotici. Sorprendentemente, la tolleranza indotta dai polimeri non è legata esclusivamente alla ridotta diffusione degli antibiotici. Inoltre, abbiamo creato un modello in vitro che riproduce la tolleranza agli antibiotici ex vivo osservata nell'espettorato in diverse eziologie di MAD, età e gravità della malattia, evidenziando l'intrinseca variabilità nelle popolazioni di P. aeruginosa evolutesi nell'ospite.
Salve. Mi chiamo Jonathan Schisler. Sono professore assistente all'Università del North Carolina a Chapel Hill. Sono il responsabile del laboratorio Schisler. Il mio laboratorio utilizza la biologia dei sistemi per studiare l'invecchiamento, sia sano che patologico, principalmente a livello cerebrale, ma anche cardiaco. Siamo inoltre coinvolti in numerose ricerche di biologia spaziale per identificare contromisure che potrebbero essere utili per i voli spaziali prolungati.
Il nostro utilizzo della biologia dei sistemi ha aperto molte porte alla collaborazione. Oggi, in particolare, parlerò della modellizzazione della tolleranza agli antibiotici e delle infezioni polmonari croniche. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con Matt Wolfgang e il suo laboratorio, anch'esso presso l'UNC Chapel Hill. Illustrerò alcune analisi dei dati che abbiamo effettuato. Tutti i dati sono stati generati da Matthew Greenwald, uno studente di dottorato di eccezionale talento nel laboratorio di Matt Wolfgang.
La malattia di cui parlerò oggi, e su cui ci concentreremo, è quella delle malattie muco-ostruttive delle vie aeree. Si tratta di una famiglia di patologie. Alcune di esse potrebbero risultare familiari, come la fibrosi cistica, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la discinesia ciliare primaria e le bronchiectasie non correlate alla fibrosi cistica. Questo rappresenta un enorme problema a livello mondiale. Quasi mezzo miliardo di persone in tutto il mondo soffre di malattie respiratorie croniche.
Negli Stati Uniti, la sola BPCO (broncopneumopatia cronica ostruttiva) rappresenta un onere economico di quasi 40 miliardi di dollari all'anno. Oltre a ciò, le persone affette da infezioni batteriche croniche presentano un aumento della mortalità di quasi il 50%. Il problema principale che affrontiamo riguarda le terapie. Questo perché, in quasi il 50% dei casi, la terapia antibiotica si rivela inefficace. Abbiamo bisogno di modelli migliori per trovare farmaci più efficaci.
Da un punto di vista fisiopatologico, quando parliamo di malattie muco-ostruttive delle vie aeree, a sinistra abbiamo vie aeree sane e a destra una rappresentazione schematica di come appaiono le vie aeree ostruite. Si tratta essenzialmente del deposito di questo muco denso e appiccicoso che riveste le vie aeree, rendendo più difficile l'ossigenazione del sangue e causando difficoltà respiratorie. Questo ambiente mucoso favorisce la proliferazione batterica e la formazione di piccole nicchie che, in ultima analisi, possono portare alla resistenza agli antibiotici. Se non trattata, può causare sepsi e insufficienza multiorgano.
Come ho già detto, il trattamento antibiotico spesso fallisce nel tempo. Se osserviamo cosa succede a una persona affetta da fibrosi cistica, la diagnosi viene solitamente posta in giovane età. Sull'asse Y, abbiamo la quantità di questi batteri, che chiameremo semplicemente PAO.
Col tempo, la quantità di batteri si accumula nelle vie respiratorie. Questi vengono trattati con antibiotici. Questo può ridurre la quantità di batteri, ma si innesca un ciclo continuo di accumulo di batteri, regressione del trattamento antibiotico e così via. Col tempo, con tutti questi trattamenti antibiotici, si innesca un processo di selezione clonale, che essenzialmente significa che vengono eliminati i batteri che si sono adattati all'ambiente e all'antibiotico. Questo adattamento porta infine a quella che chiamiamo tolleranza agli antibiotici, per cui gli antibiotici non hanno più un effetto significativo sull'eliminazione dei batteri. A questo punto, abbiamo superato la fase cronica della malattia.
Sappiamo, grazie a studi condotti negli ultimi 10 anni, che l'infezione cronica di questo PAO è associata al mancato superamento della fibrosi cistica. Può ridurre il carico della malattia, ma non sembra mai eliminare completamente i batteri.
Un altro aspetto interessante di questa ricerca è che la sensibilità all'antibiotico non predice il successo del trattamento. È possibile rimuovere i batteri dal paziente e trattarli con un antibiotico, che di fatto ucciderà i batteri nonostante non sia efficace nel paziente stesso. Si pone quindi il grande interrogativo su quale sia la differenza tra ciò che accade nel corpo e ciò che accade in laboratorio. Possiamo sviluppare modelli e metodi per comprendere meglio questo problema?
Per illustrare graficamente cosa intendiamo per resistenza agli antibiotici, si può immaginare di trattare una coltura batterica con dosi crescenti di antibiotico. Le colture sensibili agli antibiotici inizieranno a morire dopo una dose bassa, rappresentata dalla linea verde. Le specie tolleranti mostreranno una riduzione della crescita, ma in qualche modo sopravvivranno. Infine, lo scenario peggiore è quello in cui si ha una resistenza completa agli antibiotici, in cui la crescita non viene minimamente influenzata dall'aggiunta del farmaco.
Ecco Matt che osserva un poster, il quale ha sollevato delle domande davvero molto interessanti su cosa determini effettivamente la risposta agli antibiotici nelle persone rispetto a ciò che si osserva in laboratorio. Questo è stato fatto attraverso un esperimento clinico davvero notevole in cui sono stati prelevati campioni da pazienti, che chiamiamo campioni di espettorato. Letteralmente, quando si tossisce espellendo una palla di catarro, ecco di cosa stiamo parlando quando parliamo di espettorato.
Nei pazienti affetti da fibrosi cistica o BPCO, possiamo prelevare questi campioni. I batteri presenti in questi campioni possono quindi essere isolati e coltivati. In questo modo possiamo confrontare la reazione dei batteri trattati con lo stesso farmaco al di fuori del corpo del paziente rispetto a quella osservata nei pazienti stessi, trattati con lo stesso antibiotico. Questo è il trattamento che viene loro normalmente somministrato. Abbiamo condotto un esperimento davvero notevole. Abbiamo pazienti trattati con questo antibiotico e, allo stesso tempo, analizziamo il fenotipo della reazione dei batteri allo stesso antibiotico al di fuori del corpo.
È emerso con chiarezza che esisteva una discrepanza tra la sopravvivenza dei batteri all'esterno dei polmoni e quella all'interno di essi. Questo valore di MIC indica la dose di antibiotico necessaria per trattare il paziente, rispetto a quella che osserviamo quando la coltura viene fatta crescere all'esterno. Abbiamo avuto alcune colture che hanno risposto positivamente all'antibiotico, ma ovviamente, abbiamo avuto anche molte colture incredibilmente resistenti. Cosa ci rende così diversi? Cosa c'è di così diverso tra ciò che accade nelle vie aeree e ciò che accade in laboratorio?
Ci sono molti fattori diversi che potrebbero contribuire alla resistenza. Abbiamo già parlato un po' della resistenza agli antibiotici in sé, ma se rappresentiamo graficamente la resistenza agli antibiotici nel trattamento dei pazienti rispetto alla sopravvivenza in vitro, vediamo che non c'è una vera correlazione. Manca qualcosa. C'è qualcosa che non riusciamo a rilevare in queste, che chiamiamo colture in vitro, per capire cosa contribuisce alla resistenza agli antibiotici.
Matt decise di concentrarsi sull'ambiente. Cosa c'è di unico nell'ambiente all'interno di queste vie aeree ostruite che potrebbe contribuire a questa resistenza e che potrebbe essere importante da considerare nei nostri modelli? In realtà, ci sono due elementi che si sono rivelati i più facili da individuare in termini di ciò che potrebbe contribuire alla resistenza. Si tratta della mucina, che è essenzialmente la componente proteica che costituisce questo muco. È la proteina predominante del muco, così come il DNA.
Nelle vie aeree ostruite è presente una grande quantità di muco, e anche una grande quantità di DNA che fluttua liberamente, probabilmente proveniente da cellule immunitarie e altre cellule delle vie aeree in via di morte. Sappiamo che nei pazienti, con l'avanzare dell'età e il peggioramento della malattia, si riscontrano livelli più elevati sia di questa proteina mucosa, sia di questo DNA.
Matt ha condotto un esperimento davvero intelligente in cui ha preso i batteri PAO e li ha trattati con antibiotici. Quando li ha trattati con un antibiotico in assenza di questa proteina mucosa, si può notare che l'antibiotico impedisce abbastanza efficacemente la crescita batterica. Tuttavia, aumentando la quantità di proteina mucosa, si può osservare una crescita batterica sempre maggiore. Questo è il primo indizio che, forse, l'ambiente gioca un ruolo importante nel modo in cui i batteri riescono a contrastare il trattamento antibiotico. Maggiore è la quantità di proteina mucosa, maggiore è la gravità della malattia.
Questo per quanto riguarda le proteine. E il DNA? Nello stesso esperimento, manteniamo costante la proteina mucinica e possiamo variare la quantità di DNA. Man mano che aggiungiamo più DNA, iniziamo a osservare livelli di sopravvivenza più elevati. Sia il DNA che questa proteina mucinica possono aumentare la sopravvivenza o la resistenza dei batteri al trattamento antibiotico. È interessante notare che, una volta raggiunti questi livelli più elevati di proteina mucinica, l'effetto del DNA tende a diminuire leggermente. Sembra esserci una sorta di interazione tra il modo in cui il DNA e questa proteina mucinica agiscono per indurre la resistenza.
L'ultima variabile che devo introdurre prima di passare alla modellazione dei dati è la reologia, o, per dirla in un altro modo, la viscosità. La viscosità del mezzo presente nelle vie aeree, o in questo caso, nella provetta di laboratorio, è correlata sia alla quantità di proteina mucinica che al DNA. La viscosità è in parte funzione sia del contenuto proteico che di quello del DNA. Volevo presentare queste quattro variabili principali che ci interessano maggiormente nella modellazione.
Ora possiamo sfruttare JMP, e nello specifico JMP Pro. Una delle domande più importanti che Matt mi ha posto è stata: "Abbiamo questi dati e siamo molto interessati a capire come interagiscono tutte queste variabili". Una delle cose che apprezzo di più di JMP è la visualizzazione dei dati. Permette di ottenere risposte rapide in modo impeccabile attraverso splendide presentazioni grafiche. Sfruttiamo la piattaforma multivariata proprio per visualizzare velocemente le relazioni tra le nostre quattro variabili principali.
Abbiamo le nostre due variabili dipendenti, che, ripeto, sono la reologia e la viscosità di cui parlavo. Abbiamo la sopravvivenza, ovvero la capacità di superare la resistenza agli antibiotici. Poi abbiamo le nostre due variabili indipendenti, perché controlliamo la quantità di proteine, questa proteina mucinica, e controlliamo anche la quantità di DNA. Questo grafico è fantastico. Fornisce tantissime informazioni in un colpo d'occhio.
Eseguiamo un'analisi multivariata. Possiamo usarla per ottenere l'istogramma di ciascuna variabile. Possiamo facilmente osservare il diagramma a dispersione tra le variabili per individuare le relazioni più forti. Possiamo anche rappresentare graficamente il coefficiente di correlazione con una mappa di calore. Possiamo inoltre rappresentare la significatività di questi risultati utilizzando la funzione "dimensione". Con una sola istantanea, si ottengono tantissime informazioni. Questo è uno dei motivi per cui siamo grandi fan di JMP Pro.
Per quanto riguarda questo primo obiettivo, vorrei sottolineare un aspetto importante: nel mio campo, la biologia dei sistemi, dove normalmente lavoriamo con migliaia o decine di migliaia di punti dati e campioni, questo è un set di dati piuttosto ridotto. Si tratta di sole 78 osservazioni indipendenti in totale. Questo sarà fondamentale per parlare dei limiti.
Come prevedibile, questo grafico ci mostra subito che le nostre due variabili dipendenti non sono correlate, cosa che non dovrebbe accadere. È stata una buona verifica. Tuttavia, le nostre due variabili indipendenti erano fortemente correlate: la viscosità, questa variabile reologica e la sopravvivenza. È possibile osservare la forte correlazione positiva sia dal grafico a dispersione che dal coefficiente di correlazione.
Osserviamo inoltre che ogni variabile indipendente aveva una controparte dipendente davvero predominante. Se consideriamo la quantità di questa proteina mucosa, possiamo notare una correlazione positiva molto forte con la sopravvivenza, rappresentata dal grafico a dispersione e dal quadrante superiore del punteggio di correlazione. Per quanto riguarda il DNA, abbiamo osservato la correlazione positiva più forte con il fattore di viscosità, rappresentato in questo riquadro e dal punteggio della costante di correlazione.
È stato fantastico. Ma una delle domande di Matt e Matt era: "Bene, come possiamo modellare tutto questo insieme?". Sono interessati a provare a esprimere questi fattori in un modello matematico che potremmo poi analizzare e testare, premere pulsanti e disegnare leve per vedere cosa succede.
Vorrei almeno elogiare la funzione di confronto dei modelli. È una funzione che ho utilizzato spesso in questo software. Tuttavia, sono andato un po' al sodo, sono stato un po' pignolo e alla fine ho optato per la regressione ai minimi quadrati parziali, in parte per esperienza e in base ai dati a disposizione.
Il fatto che abbiamo due variabili Y e alcune variabili X che presentano anche una certa correlazione tra loro. Il fatto che io voglia tenere conto del termine di interazione, e la regressione PLS sembrava essere particolarmente adatta a questo scopo. Possiamo già dedurre da questi dati iniziali che probabilmente ci sarà un'interazione interessante tra le nostre due variabili X, ovvero la proteina mucina e il contenuto di DNA.
Anche in questo caso, si tratta di dati relativamente scarsi, quindi la nostra convalida incrociata è in qualche modo limitata. Al momento della pubblicazione di questo articolo, non disponevamo di un set di dati di convalida indipendente, ma stiamo lavorando per ottenerlo. Bisogna tenere presente che la generazione di modelli può causare overfitting. Questo ci permette comunque di esplorare ciò che pensiamo stia accadendo nella relazione tra queste quattro variabili.
Utilizziamo la funzione di adattamento del modello all'interno di JMP Pro. Anche in questo caso, utilizziamo i minimi quadrati parziali con le nostre due Y e le nostre due X, con tre fattori e includendo il termine di interazione. Sia i fattori indipendenti che il termine di interazione hanno restituito punteggi VIP superiori a 0,8. Li abbiamo mantenuti tutti all'interno del modello. Ho incluso le correlazioni qui solo come quadro di riferimento.
Se osserviamo i coefficienti del modello della regressione PLS, possiamo notare che, tenendo conto della mucina (ovvero la proteina) e dell'interazione proteina-DNA, il coefficiente Beta risulta essere il più elevato per il DNA in relazione alla viscosità. Per quanto riguarda la sopravvivenza, il coefficiente più elevato è stato riscontrato con la proteina mucina. Siamo stati in grado di utilizzare queste informazioni per iniziare a comprendere meglio come tutte queste variabili siano correlate tra loro.
Eseguiamo i soliti controlli di qualità confrontando i valori effettivi con quelli previsti. Nel grafico a dispersione a sinistra, abbiamo il grafico della viscosità o reologia, che confronta i valori effettivi con quelli previsti, e anche la sopravvivenza. Valori effettivi rispetto a quelli previsti. Ovviamente, mi piace sempre fare questa verifica di coerenza. Che aspetto ha l'equazione? Mi fa piacere. Questo è il risultato sia della nostra viscosità che della percentuale di sopravvivenza in funzione della proteina mucinica, del DNA e del loro termine di interazione.
Un altro ottimo strumento di JMP è lo strumento di predizione. Mi piace molto usarlo per capire come potrebbe funzionare il modello. Ovviamente, i nostri collaboratori lo trovano sempre molto interessante. Una delle difficoltà che ho sempre incontrato è stata quella di trovare il modo migliore per condividere gli spazi di lavoro. Sono felice di poter dire che almeno ho esplorato un po' JMP Live e il dominio pubblico di JMP, il che si è rivelato incredibilmente utile per condividere i nostri dati. Voglio anche sottolineare quanto sia importante, soprattutto per il mondo accademico, avere gli strumenti per rendere i nostri dati accessibili e condividerli in modo imparziale.
Sono davvero entusiasta di saperne di più su JMP Live e su come possiamo integrarlo nella nostra reportistica dei dati. Quando abbiamo pubblicato un articolo, abbiamo incluso un link a quest'area di lavoro, in modo che le persone potessero accedervi, sperimentare con il profilo e scaricare tutti i dati grezzi. Questo è un elemento fondamentale per garantire la riproducibilità e il rigore della nostra ricerca.
Un altro aspetto positivo del predittore era la possibilità di vedere come questo modello potesse funzionare su un'ampia gamma di input. Un'altra caratteristica interessante è la possibilità di utilizzarlo per eseguire simulazioni Monte Carlo. Anche questa è una delle funzionalità più potenti di JMP che utilizziamo molto spesso.
Giusto per mostrarvelo, in questo caso abbiamo la nostra componente proteica e la nostra componente di DNA. È fantastico poter utilizzare valori derivati sperimentalmente o clinicamente per regolare la distribuzione da cui vogliamo prelevare i campioni. In questo caso, utilizziamo la distribuzione normale troncata perché abbiamo valori minimi e massimi sperimentali a cui volevamo limitare la distribuzione. Quindi possiamo usare questi dati per eseguire un paio di migliaia di simulazioni e cercare di vedere come il modello potrebbe comportarsi in una gamma di input.
Ancora una volta, questo è un ottimo esempio di come JMP e l'utilizzo di Graph Builder siano particolarmente utili, perché permette di visualizzare facilmente i singoli grafici di tutte le 1.000 simulazioni, permettendo di individuare rapidamente le relazioni più interessanti all'interno del modello. La possibilità di riassumere un modello a quattro variabili in modo elegante, rappresentando la concentrazione di DNA, la concentrazione proteica, la viscosità e la sopravvivenza all'interno di un contesto plausibile, è davvero notevole. L'interpretabilità chiara ed elegante è una caratteristica eccellente.
Un altro aspetto importante che volevo menzionare è il profiler di interazione. Quando costruiamo modelli, ovviamente, non vogliamo aggiungere termini di interazione che non abbiano molto senso e che creino rumore nel modello. Il profilo di interazione è uno strumento davvero utile per identificare rapidamente dove un'interazione potrebbe essere davvero vantaggiosa da includere nel modello. Questa è un'altra fantastica funzionalità di JMP.
Per raggiungere questo obiettivo, cosa abbiamo imparato? Costruendo questo modello PLS, cosa apprendiamo dai dati del grande esperimento di Matt? Innanzitutto, abbiamo appreso che la resistenza agli antibiotici, o in questo caso, quantifichiamo questo parametro come sopravvivenza, era positivamente correlata alla mucina a tutte le concentrazioni di DNA. Abbiamo queste pendenze positive della proteina mucina in relazione alla sopravvivenza, sia a basse che ad alte concentrazioni di DNA. Anche in questo grafico, se osservate attentamente, potete notare la stessa relazione.
Abbiamo anche osservato un'associazione positiva tra la mucina e la viscosità, che si indeboliva all'aumentare della concentrazione di DNA. Ciò è particolarmente evidente nel grafico di interazione. Possiamo notare che la viscosità aumentava con la concentrazione di mucina in assenza di DNA. Tuttavia, a livelli più elevati di DNA, la pendenza si inverte completamente.
Questo dimostra elegantemente che osserviamo un effetto differenziale, soprattutto quando raggiungiamo questi livelli moderati o elevati di DNA, sulla correlazione positiva tra viscosità e sopravvivenza. Penso che sia stato un modo davvero efficace per collegare queste quattro variabili in un modo che ha anche molto senso dal punto di vista scientifico. La concentrazione di mucina e proteine sembra essere davvero il fattore determinante della resistenza batterica, almeno nel nostro modello di coltura cellulare. Ma può certamente essere modificata dalla quantità di DNA extracellulare presente.
L'ultimo esempio di come abbiamo sfruttato JMP in questo studio è stato quello di porci la domanda... Forse abbiamo solo bisogno di modelli migliori. Vogliamo utilizzare in laboratorio modelli che riflettano più fedelmente ciò che accade, in questo caso, nelle vie aeree dei pazienti. Abbiamo già dimostrato come, iniziando a considerare questa proteina mucinica e il DNA, sembriamo riprodurre questo fenotipo di resistenza agli antibiotici. Cosa possiamo imparare sulla costruzione di modelli migliori?
Nell'ultimo esperimento, Matt ha isolato i batteri da tutti questi pazienti. Poi ha coltivato quei batteri con quantità crescenti di proteina mucinica. La domanda era: esisteva una condizione specifica in laboratorio che rappresentasse al meglio ciò che effettivamente osserviamo nelle vie respiratorie dei pazienti? Sorprendentemente, abbiamo scoperto che utilizzando quella proteina mucinica a una concentrazione del 2% abbiamo ottenuto circa... direi il 90% delle colture più simili ai dati dei pazienti rispetto a tutte le altre concentrazioni di mucina. Possiamo anche rappresentarlo graficamente in modo elegante, mostrando la differenza tra ciò che osserviamo in laboratorio in vitro e ciò che osserviamo ex vivo nei pazienti.
Ovviamente, più ci avviciniamo allo zero, meglio riproduciamo ciò che osserviamo nei pazienti. Come si può vedere, a questo livello di mucina del 2%, quasi tutti i campioni dei pazienti rientrano in questo intervallo ottimale. Ora abbiamo questi due valori anomali. È davvero interessante osservare cosa li differenzia. Questo approccio si è rivelato un ottimo metodo di indagine. Possiamo identificare modelli migliori per studiare questa malattia?
Riassumendo brevemente, abbiamo scoperto che la concentrazione del polimero mucoso, costituito sia dalla proteina mucinica stessa che da questo DNA extracellulare, determina la tolleranza agli antibiotici del PAO. Possiamo utilizzare i nostri modelli matematici per identificare modelli in vitro più adatti allo studio della resistenza agli antibiotici.
JMP Pro è utile in ogni fase dell'elaborazione dei dati, dallo sviluppo dei modelli alla visualizzazione, fino alla condivisione e alla creazione di report. So di non aver avuto modo di illustrare tutte queste diverse componenti, ma utilizziamo JMP in tutto il nostro flusso di dati e si è rivelato incredibilmente utile. Vi ringrazio tutti per l'attenzione.
