Chez les personnes atteintes de maladies obstructives des voies respiratoires (MAR), l'environnement des voies respiratoires est caractérisé par un mucus déshydraté dû à une hyperabsorption du liquide de surface des voies respiratoires et à une altération de la clairance mucociliaire. À mesure que les MAR progressent, le mucus pathologique devient de plus en plus visqueux en raison d'une surproduction de mucine et d'une accumulation d'ADN extracellulaire (ADNe) d'origine hôte. Pseudomonas aeruginosa, un pathogène majeur des MAR, colonise ce microenvironnement muqueux de façon persistante. Malgré les traitements antibiotiques inhalés et l'absence de résistance aux antibiotiques, l'échec du traitement antipseudomonas demeure un défi clinique.
Nous avons utilisé la visualisation des données et la modélisation statistique de JMP pour étudier comment les concentrations de mucine et d'ADN extracellulaire (ADNe) – polymères dominants du mucus respiratoire – influencent la tolérance aux antibiotiques de *P. aeruginosa* afin de comprendre sa résistance aux antibiotiques. Nos résultats révèlent que la concentration et le poids moléculaire des polymères ont un impact sur la survie de *P. aeruginosa* après exposition aux antibiotiques. De façon surprenante, la tolérance induite par les polymères n'est pas uniquement liée à une diffusion réduite des antibiotiques. De plus, nous avons établi un modèle *in vitro* qui reproduit la tolérance aux antibiotiques *ex vivo* observée dans les expectorations, et ce, pour différentes étiologies, âges et degrés de gravité de la maladie, soulignant ainsi la variabilité intrinsèque des populations de *P. aeruginosa* ayant évolué chez l'hôte.
Bonjour. Je m'appelle Jonathan Schisler. Je suis maître de conférences à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill et directeur du laboratoire Schisler. Mon laboratoire utilise la biologie des systèmes pour étudier le vieillissement, tant sain que pathologique, principalement au niveau cérébral, mais aussi cardiaque. Nous menons également de nombreuses recherches en biologie spatiale afin d'identifier des contre-mesures potentiellement utiles pour les vols spatiaux de longue durée.
Notre recours à la biologie des systèmes a ouvert de nombreuses perspectives de collaboration. Aujourd'hui, je vais vous parler de la modélisation de la tolérance aux antibiotiques et des infections pulmonaires chroniques. Ce travail a été réalisé en collaboration avec Matt Wolfgang et son laboratoire, également à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. Je vous présenterai quelques analyses de données que nous avons effectuées. Toutes les données ont été générées par Matthew Greenwald, un doctorant exceptionnellement talentueux du laboratoire de Matt Wolfgang.
La maladie dont je vais vous parler aujourd'hui, et sur laquelle nous allons nous concentrer, est celle des maladies obstructives des voies respiratoires muqueuses. Il s'agit d'une famille de maladies. Certaines vous seront peut-être familières, comme la mucoviscidose, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la dyskinésie ciliaire primitive et la bronchectasie non liée à la mucoviscidose. C'est un problème majeur à l'échelle mondiale. Près d'un demi-milliard de personnes dans le monde souffrent de maladies respiratoires chroniques.
Aux États-Unis, la BPCO représente à elle seule un fardeau économique de près de 40 milliards de dollars par an. De plus, les personnes atteintes d'infections bactériennes chroniques présentent une mortalité accrue de près de 50 %. Le principal obstacle réside dans les traitements, car l'échec des antibiotiques survient dans près de 50 % des cas. Il nous faut donc de meilleurs modèles pour identifier des médicaments plus efficaces.
D'un point de vue physiopathologique, lorsqu'on parle de ces maladies obstructives des voies respiratoires, à gauche, on voit une voie respiratoire saine, et à droite, un schéma illustrant une voie respiratoire obstruée. Il s'agit essentiellement du dépôt d'un mucus épais et collant qui tapisse les voies respiratoires et qui rend l'oxygénation du sang plus difficile, entraînant une insuffisance respiratoire. Ce milieu muqueux favorise la prolifération bactérienne et la création de micro-réseaux qui peuvent, à terme, induire une résistance aux antibiotiques. Sans traitement, cette obstruction peut conduire à une septicémie et à une défaillance multiviscérale.
Comme je l'ai mentionné, l'échec des traitements antibiotiques au fil du temps est très fréquent. Chez les personnes atteintes de mucoviscidose, le diagnostic est généralement posé dès le plus jeune âge. Sur l'axe des ordonnées, nous avons la quantité de ces bactéries, que nous appellerons simplement PAO.
Avec le temps, les bactéries prolifèrent dans les voies respiratoires. Elles sont alors traitées par antibiotiques. Cela permet de réduire la quantité de bactéries, puis on assiste à un cycle constant d'accumulation bactérienne, de régression liée au traitement antibiotique, et ainsi de suite. Au fil du temps, ces traitements antibiotiques répétés induisent un processus de sélection clonale, c'est-à-dire que les bactéries qui se sont adaptées à l'environnement et à l'antibiotique sont éliminées. Cette adaptation conduit finalement à ce que l'on appelle la tolérance aux antibiotiques : ces derniers n'ont alors plus d'effet significatif sur l'élimination des bactéries. On entre alors dans la phase de maladie chronique.
Des études menées au cours des dix dernières années ont montré qu'une infection chronique par cette bactérie est associée à l'échec du traitement de la mucoviscidose. Ce traitement peut atténuer la gravité de la maladie, mais il ne semble jamais permettre l'élimination complète de la bactérie.
L'autre aspect intéressant de cette recherche est que la sensibilité à l'antibiotique ne prédit pas le succès du traitement. On peut extraire les bactéries du patient et le traiter avec un antibiotique, et celui-ci finira par les tuer même s'il est inefficace chez le patient lui-même. Une question importante se pose alors : quelle est la différence entre ce qui se passe dans l'organisme et ce qui se passe en laboratoire ? Pourrions-nous élaborer des modèles et des méthodes permettant de mieux comprendre ce problème ?
Pour illustrer graphiquement ce que l'on entend par résistance aux antibiotiques, imaginez le traitement d'une culture bactérienne avec des doses croissantes d'antibiotique. Les cultures sensibles aux antibiotiques commencent généralement à mourir après une faible dose, ce qui est représenté par cette ligne verte. Les espèces tolérantes présentent une légère diminution de croissance, mais survivent quelque peu. Enfin, le pire des scénarios est celui d'une résistance totale aux antibiotiques, où la croissance n'est plus affectée par l'ajout du médicament.
Voici Matt, penché sur un poster, qui a soulevé des questions vraiment passionnantes concernant les mécanismes de la réponse aux antibiotiques chez l'humain, par rapport à ce qui est observé en laboratoire. Ces questions sont abordées dans le cadre d'une expérience clinique remarquable, où des échantillons de patients ont été prélevés ; il s'agit d'expectorations. Concrètement, ce sont des glaires que l'on crache en toussant.
Chez les patients atteints de mucoviscidose ou de BPCO, nous pouvons prélever des échantillons. Les bactéries présentes dans ces échantillons peuvent ensuite être isolées et cultivées. Nous pouvons alors comparer l'effet d'un traitement médicamenteux administré à ces bactéries hors de l'organisme avec celui observé chez les patients eux-mêmes, traités avec les mêmes antibiotiques. Il s'agit de leur traitement habituel. Nous menons une expérience remarquable : nous traitons des patients avec cet antibiotique, et parallèlement, nous analysons le phénotype des bactéries en réponse à ce même antibiotique hors de l'organisme.
Il est devenu évident qu'il existait un décalage entre la survie des bactéries hors du poumon et à l'intérieur de celui-ci. Le niveau de CMI indique la dose d'antibiotique nécessaire pour traiter le patient, comparée à celle observée lorsque la culture est réalisée hors du poumon. Certaines cultures ont bien réagi à l'antibiotique, mais de nombreuses autres étaient extrêmement résistantes. Qu'est-ce qui explique cette différence ? Qu'est-ce qui différencie ce qui se passe dans les voies respiratoires de ce qui se passe en laboratoire ?
De nombreux facteurs peuvent contribuer à la résistance. Nous avons déjà abordé la résistance aux antibiotiques elle-même, mais si l'on compare la résistance aux antibiotiques chez les patients traités et la survie in vitro, on constate qu'il n'y a pas de corrélation. Il manque un élément. Nos cultures in vitro ne permettent pas de saisir tous les facteurs contribuant à la résistance aux antibiotiques.
Matt a décidé de se concentrer sur l'environnement. Qu'est-ce qui est unique dans cet environnement, au sein de ces voies respiratoires obstruées, et qui pourrait contribuer à cette résistance ? Il serait important d'en tenir compte dans nos modèles. Deux éléments se sont révélés particulièrement pertinents quant à leur contribution potentielle à cette résistance : la mucine, composant protéique essentiel du mucus et protéine prédominante, ainsi que l'ADN.
Dans ces voies respiratoires obstruées, on observe une grande quantité de mucus, ainsi que de l'ADN en suspension, probablement issu de la mort de cellules immunitaires et d'autres cellules des voies respiratoires. On sait que chez les patients, à mesure qu'ils vieillissent et que la maladie progresse, les taux de cette protéine du mucus et de cet ADN augmentent.
Matt a mené une expérience très ingénieuse : il a traité des bactéries PAO avec des antibiotiques. En l'absence de cette protéine muqueuse, le traitement antibiotique inhibe efficacement toute prolifération bactérienne. Cependant, plus la quantité de protéine muqueuse augmente, plus les bactéries se multiplient. C'est un premier indice suggérant que l'environnement joue un rôle important dans la capacité des bactéries à résister au traitement antibiotique. Plus la quantité de protéine muqueuse est élevée, plus la maladie est grave.
Cela concerne les protéines. Qu'en est-il de l'ADN ? Dans la même expérience, nous maintenons la concentration de la protéine muqueuse constante et nous faisons varier la quantité d'ADN. À mesure que nous ajoutons de l'ADN, nous observons une augmentation du taux de survie. L'ADN et la mucine peuvent tous deux accroître la survie des bactéries ou leur résistance au traitement antibiotique. Curieusement, lorsque la concentration de mucine atteint des niveaux élevés, l'effet de l'ADN tend à s'atténuer légèrement. Il semble donc exister une interaction entre l'ADN et la mucine quant à l'induction de la résistance.
La dernière variable que je dois introduire avant d'aborder la modélisation des données est la rhéologie, ou viscosité. La viscosité du milieu présent dans les voies respiratoires, ou dans ce cas précis, dans le tube à essai, est liée à la quantité de mucine et d'ADN. La viscosité dépend en partie de la concentration de ces deux protéines et de l'ADN. Je souhaitais présenter ces quatre principales variables que nous souhaitons modéliser.
Nous pouvons désormais exploiter JMP, et plus précisément JMP Pro. Matt m'a dit : « Nous avons ces données et nous souhaitons vraiment comprendre comment toutes ces variables interagissent. » Ce que j'apprécie particulièrement dans JMP, c'est la visualisation des données. Elle permet d'obtenir rapidement des réponses claires grâce à de superbes présentations graphiques. Nous utilisons la plateforme multivariée pour visualiser rapidement les relations entre nos quatre principales variables.
Nous avons nos deux variables dépendantes, à savoir la rhéologie de cette viscosité dont je parlais, et la survie, c'est-à-dire la capacité à contourner la résistance aux antibiotiques. Nous avons ensuite nos deux variables indépendantes : la quantité de protéine (la mucine) et la quantité d'ADN. Ce graphique est excellent ; il fournit une mine d'informations en un instant.
Nous effectuons une analyse multivariée. Celle-ci nous permet d'obtenir l'histogramme de chaque variable. L'examen du nuage de points nous permet d'identifier facilement les corrélations les plus fortes. Nous pouvons ensuite représenter graphiquement le coefficient de corrélation à l'aide d'une carte thermique. La signification de ces résultats est également illustrée par la fonction « taille ». En un seul coup d'œil, nous obtenons une quantité impressionnante d'informations. C'est l'une des raisons pour lesquelles nous apprécions particulièrement JMP Pro.
Concernant ce premier objectif, je tiens à souligner un point important : dans le domaine de la biologie des systèmes, où nous traitons habituellement des milliers, voire des dizaines de milliers de points de données et d’échantillons, il s’agit ici d’un ensemble de données relativement restreint. Il ne comprend que 78 observations indépendantes. Ce point sera crucial pour aborder les limitations de cette étude.
Comme prévu, ce graphique nous indique rapidement que nos deux variables dépendantes ne sont pas corrélées, ce qui est logique. C'était une bonne vérification. En revanche, nos deux variables indépendantes étaient fortement corrélées : la viscosité (variable rhéologique) et la survie. Cette forte corrélation positive est visible à la fois sur le nuage de points et grâce au coefficient de corrélation.
Nous observons également que chaque variable indépendante avait une variable dépendante prédominante. Si l'on considère la quantité de cette protéine muqueuse, on constate une très forte corrélation positive avec la survie, représentée par le nuage de points et le quadrant supérieur du coefficient de corrélation. Quant à l'ADN, la plus forte corrélation positive a été observée avec le facteur de viscosité, représenté dans cet encadré et par le coefficient de corrélation.
C'était super. Mais Matt et Matt se demandaient : « Comment modéliser tout ça ensemble ? » Ils cherchent à exprimer ces facteurs dans un modèle mathématique que l'on pourrait ensuite interroger, tester, manipuler et ajuster pour observer les résultats.
Je tiens à souligner l'utilité de la fonction de comparaison de modèles. Je l'ai utilisée très souvent. Cependant, j'ai été un peu direct et exigeant, et j'ai finalement opté pour la régression des moindres carrés partiels, en partie grâce à mon expérience et aux données disponibles.
Le fait que nous ayons deux variables Y et des variables X qui présentent également une certaine association entre elles, ainsi que la volonté de prendre en compte les termes d'interaction, fait de la régression PLS un outil particulièrement adapté. Les données initiales suggèrent déjà une interaction intéressante entre nos deux variables X, à savoir la protéine mucine et la teneur en ADN.
Là encore, les données sont relativement peu nombreuses, ce qui limite notre validation croisée. Au moment de la publication de cet article, nous ne disposions pas d'un jeu de données de validation indépendant ; son élaboration est en cours. Il faut rester vigilant face au risque de surapprentissage des modèles. Cela nous permet néanmoins d'explorer notre hypothèse quant à la relation entre ces quatre variables.
Nous utilisons la fonction d'ajustement de modèle de JMP Pro. Nous avons de nouveau utilisé la méthode des moindres carrés partiels avec nos deux variables indépendantes (Y) et nos deux variables explicatives (X), en considérant trois facteurs et en incluant le terme d'interaction. Les facteurs indépendants et le terme d'interaction ont tous obtenu des scores VIP supérieurs à 0,8. Nous les avons donc conservés dans le modèle. Les corrélations sont présentées ici à titre indicatif.
Si l'on examine les coefficients du modèle de régression PLS, on constate que, même en contrôlant la mucine (la protéine) et l'interaction protéine-ADN, le coefficient bêta de la viscosité reste le plus élevé pour l'ADN. Concernant la survie, le coefficient le plus élevé est associé à la protéine mucine. Ces informations nous ont permis de mieux comprendre les relations entre ces variables.
Nous effectuons les contrôles qualité habituels en comparant les valeurs réelles aux valeurs prédites. Sur le graphique de gauche, nous avons notre graphique de viscosité (ou rhéologie) comparant les valeurs réelles aux valeurs prédites, ainsi que le taux de survie. Valeurs réelles versus valeurs prédites. Bien sûr, j'aime toujours vérifier la cohérence des résultats. À quoi ressemble l'équation ? Cela me rassure. Il s'agit du résultat de nos calculs de viscosité et de pourcentage de survie en fonction de la protéine mucine, de l'ADN et de leur interaction.
Un autre outil formidable de JMP est l'outil de prédiction. J'ai beaucoup aimé l'explorer pour mieux comprendre le fonctionnement du modèle. Bien sûr, nos collaborateurs le trouvent toujours très intéressant. J'ai toujours eu du mal à trouver la meilleure façon de partager les espaces de travail. Heureusement, j'ai exploré JMP Live et le domaine public de JMP, ce qui s'est avéré extrêmement utile pour partager nos données. Je tiens également à souligner l'importance, notamment pour les chercheurs, de pouvoir rendre nos données accessibles et les partager de manière impartiale.
J'ai été ravi d'en apprendre davantage sur JMP Live et sur la manière de l'intégrer à nos rapports de données. Lors de la publication d'un article, nous avons inclus un lien vers cet espace de travail, permettant ainsi aux lecteurs d'explorer le profil et de télécharger les données brutes. Il s'agit d'un élément essentiel à la rigueur et à la reproductibilité de nos recherches.
L'autre avantage de ce prédicteur était de pouvoir observer son fonctionnement sur un large éventail de données d'entrée. Une autre fonctionnalité intéressante est la possibilité d'effectuer des simulations de Monte Carlo. Il s'agit là encore d'une fonctionnalité très performante de JMP que nous utilisons fréquemment.
Pour vous donner un exemple, dans ce cas précis, nous avons notre composante protéique et notre composante ADN. L'avantage est de pouvoir utiliser des valeurs expérimentales ou cliniques pour ajuster la distribution des échantillons. Ici, nous utilisons une distribution normale tronquée, car nous disposions de valeurs minimales et maximales expérimentales que nous souhaitions contraindre. Nous pouvons ensuite utiliser ces données pour effectuer plusieurs milliers de simulations et évaluer les performances du modèle pour différentes valeurs d'entrée.
Une fois de plus, JMP et son générateur de graphiques offrent une excellente solution : il suffit d'examiner les graphiques un par un pour l'ensemble des 1 000 simulations afin de déceler d'éventuelles corrélations intéressantes au sein du modèle. On peut ainsi synthétiser un modèle à quatre variables de manière élégante, en intégrant la concentration d'ADN, la concentration de protéines, la viscosité et la survie dans un contexte réaliste. Cette interprétabilité claire et élégante est un atout majeur.
L'autre point important que je voulais aborder concerne également le profileur d'interactions. Lors de la construction de modèles, il est essentiel d'éviter d'ajouter des termes d'interaction superflus qui perturbent le modèle. Le profil d'interactions est un outil précieux pour identifier rapidement les interactions pertinentes à inclure dans votre modèle. C'est une autre fonctionnalité remarquable de JMP.
Pour atteindre cet objectif, qu'avons-nous appris ? En construisant ce modèle PLS, que pouvons-nous tirer des données de la grande expérience de Matt ? Premièrement, nous avons constaté que la résistance aux antibiotiques, ou dans ce cas, la survie, était positivement associée à la mucine pour toutes les concentrations d'ADN. Nous observons des pentes positives pour la protéine mucine en fonction de la survie, que les concentrations d'ADN soient faibles ou élevées. Ce même constat est également visible sur le graphique ci-dessus.
Nous avons également observé une corrélation positive entre la mucine et la viscosité, corrélation qui s'atténue avec l'augmentation de la concentration d'ADN. Ce phénomène est particulièrement visible sur le graphique d'interaction. On constate que la viscosité augmente avec la concentration de mucine en l'absence d'ADN. Mais pour des concentrations d'ADN plus élevées, la pente s'inverse complètement.
Cela démontre élégamment l'effet différentiel observé, notamment pour des concentrations d'ADN modérées ou élevées, sur la corrélation positive entre la viscosité et la survie. Je trouve que c'était une excellente façon de relier ces quatre variables, d'une manière scientifiquement très cohérente. La concentration de mucine et de protéines semble bien être le principal facteur déterminant de la résistance bactérienne, du moins dans notre modèle de culture cellulaire. Mais elle peut certainement être modulée par la quantité d'ADN extracellulaire présente.
Le dernier exemple d'utilisation de JMP dans cette étude consiste à se poser la question suivante : « Peut-être avons-nous simplement besoin de meilleurs modèles. » Nous souhaitons utiliser en laboratoire des modèles qui reflètent plus fidèlement ce qui se passe, en l'occurrence, dans les voies respiratoires des patients. Nous avons déjà démontré qu'en intégrant cette protéine mucine et cet ADN, nous parvenons à reproduire ce phénotype de résistance aux antibiotiques. Que pouvons-nous apprendre pour concevoir de meilleurs modèles ?
Lors de la dernière expérience, Matt a isolé les bactéries de tous ces patients. Il a ensuite cultivé ces bactéries en présence de concentrations croissantes de mucine. La question était de savoir s'il existait, en laboratoire, des conditions optimales pour reproduire au mieux celles observées dans les voies respiratoires des patients. De façon remarquable, nous avons constaté qu'une concentration de mucine de 2 % permettait d'obtenir environ 90 % de cultures présentant les caractéristiques les plus proches des données cliniques, comparativement aux autres concentrations testées. Nous pouvons d'ailleurs illustrer ce résultat de manière claire et concise, en représentant la différence entre les résultats obtenus in vitro et ceux observés ex vivo chez les patients.
De toute évidence, plus on se rapproche de zéro, mieux on reproduit ce qu'on observe chez les patients. On constate qu'à ce taux de mucine de 2 %, la quasi-totalité des échantillons de patients se situent dans cette zone optimale. Nous avons maintenant deux valeurs aberrantes. Ces valeurs sont particulièrement intéressantes à analyser afin de comprendre leurs différences. Cette approche s'est avérée très efficace pour explorer cette pathologie. Pourrons-nous identifier de meilleurs modèles pour l'étude de cette maladie ?
En résumé, nous avons constaté que la concentration de polymères muqueux, composée à la fois de la protéine mucine elle-même et de cet ADN extracellulaire, détermine la tolérance aux antibiotiques de PAO. Nos modèles mathématiques nous permettent d'identifier de meilleurs modèles in vitro pour étudier la résistance aux antibiotiques.
JMP Pro est utile à chaque étape du traitement des données, du développement de modèles, de la visualisation, du partage et de la production de rapports. Je n'ai certes pas eu l'occasion de détailler tous ces aspects, mais nous utilisons JMP tout au long de notre chaîne de traitement des données, et son utilité est indéniable. Merci à tous pour votre attention.
