Pharmaron 開發了一個平台流程來產生腺相關病毒 (AAV) 基因療法，並採用高度自適應的工具箱來管理不同的 AAV 產品和血清型。我們的工具箱可以透過製造可行性評估快速評估產品與我們平台的兼容性，並對一系列參數進行微調，以有針對性地優化流程。
Pharmaron 最佳化方法的一個重要工具是 DOE（實驗設計）。我們展示瞭如何透過中心複合 DOE 方法確定初始 AAV 純化過程的捕獲步驟的最佳停留時間、負載密度和負載 pH 來最大限度地提高單體 AAV 的回收率。使用 Capsid ELISA 和多角度動態光散射 (MADLS) 測定滴度以及使用 DLS 測定單體百分比來測量最佳負載條件。 DOE分析表明，負載密度和單體含量之間存在很強的聯繫，即負載密度越高，單體病毒的產量就越高。負載 pH 值和停留時間對回收率和單體性的影響可以忽略不計。
您好，我叫 Damon Ho，我是 Pharmaron Biologics UK 的科學助理 III，工作地點在利物浦。感謝您收聽本次演講。我非常自豪能夠在利物浦約翰莫爾斯大學 Pharmaron Biologics 實習期間完成這項工作。更高興的是，JMP 在我們捕捉色譜步驟的成功優化中發揮了重要作用。
繼續看海報的第一部分。向那些可能以前從未聽說過我們的人介紹 Pharmaron，我們是一家業務遍布全球的領先製藥研發服務提供者。在利物浦，我們目前致力於基於病毒載體的基因療法開發和臨床製造，目前重點關注腺相關病毒或 AAV。
在 Pharmaron，我們擁有令人印象深刻的平台流程，可以生產多種 AAV 血清型和產品，如圖 1 所示。
這個過程利用深度過濾，然後進行捕獲色譜法，然後進行中間拋光色譜法，然後進行拋光色譜法，進入我們的配方步驟，最後進行無菌過濾。
現在我來向大家介紹我們的機器人和JMP的使用。我們非常自豪地與大家分享，我們擁有一台名為 Beckman Biomek i7 的最先進的高通量製程開發機器人，如圖 2 和圖 3 所示，它可以快速評估產品與我們平台的契合度，並最終調整參數以實現其與我們製程的無縫整合。
利用該機器人進行 HTPD 並結合使用 JMP 進行 DoE，我們可以在比傳統方法更短的時間內產生高產量、高純度的藥物產品。
這張海報重點介紹如何優化我們平台流程中針對 AAV 產品的初始捕獲色譜步驟。
使用 JMP 軟體設計了 DoE，以確定最佳的加工負載條件。選擇三個因素進行最佳化，即停留時間、負載密度和負載 pH，以病毒滴度和病毒聚集作為輸出進行測量。
現在，讓我們快速了解如何在 JMP 中設計 DoE。出於多種原因，選擇中心複合設計（CCD）來創建 DoE。首先，需要最少數量的因子組合來估計主效應，並且它能夠分析雙因子交互作用和二次效應。
CCD 還具有良好的擬合度檢測能力，可以輕鬆顯示哪些因素會影響所選結果，並且可以透過 JMP 中提供的各種工具進行圖形分析，正如您在海報中看到的那樣。
在 JMP 中建立 CCD 的方法首先是選擇響應曲面設計，輸入加載 pH、加載密度和停留時間的參數名稱，然後輸入預先定義的高低範圍。目標是最大限度地提高單體病毒含量和病毒衣殼恢復率，因此這些都是在響應部分輸入的。
該軟體非常靈活，您可以隨時在完成的模型中添加更多回應。在這種情況下，由於這是一個傳統的 CCD，因此選擇了臉部。對中心點選擇了三次測量。然後就可以產生 CCD 了。總共透過 CCD 模型產生了 17 種不同的實驗條件，具有不同的低、中、高參數。中心點被定義為構成 CCD 模型基礎的所有中等參數，低參數和高參數作為探針來測試因素如何相互作用和影響。
這形成了一個 3D 響應曲面，可以相當準確地預測因子之間的交互作用。使用 JMP，可以假設最終條件並在後續的確認運行中進行測試。
我們的 HTPD 機器人用於在非常小的規模上執行捕獲色譜分析，允許同時運行多種條件，這在實驗室規模下需要更長的時間。由於其自動化特性，該系統可以實現高度準確且可重複的過程。
一旦所有條件都在 Biomek i7 平台上運行，我們就會利用我們世界一流的分析技術，透過酶聯免疫吸附試驗、縮短二元器和多角度動態光散射（也稱為 MADLS）來測量 AAV 衣殼滴度。
單體病毒含量透過常規動態光散射或DLS測量。 JMP 不僅使用實驗研究的設計，也用於結果分析。
一旦獲得分析數據，就將其輸入到 JMP 中，並能以多種不同的方式對數據進行可視化，包括圖 4、圖 4a、4b 和 4c 中顯示的對照圖。運行模擬以產生數以萬計的虛擬結果，這有助於建立最佳化模型，並與真實世界的實驗數據進行比較以建立模型的置信度。如圖 5 所示。
等高線圖突顯了較高負載密度的影響，這增加了病毒單體含量，如圖 4a 所示為棕色。然而，在分析衣殼 ELISA 回收率（圖 4b 中突出顯示）時，結果顯示較低的加載密度（此處也以棕色顯示）可獲得最高的衣殼產量。圖 4c 所示的 MADLS 數據對此提出了質疑，該數據提供了證據支持更高的負載密度對增加病毒單體含量的影響，如右下角的棕色和紅色和橙色所示。
一個重要的考慮是 MADLS 沒有測量總量，因此證實了 DLS 的發現。 Ph 和停留時間對衣殼滴度、MADLS 或 DLS 結果沒有顯著影響，因此本海報中未包含等高線圖。
現在，我們可以繼續解釋研究結果。在分析了三種學習條件之後，學習密度對衣殼恢復和 AAV 的單體性質具有最顯著的影響，這可以透過圖 6 所示的預測分析器左側移植上的線的陡峭梯度來直觀地看出。
中央圖表中顯示的停留時間對單體病毒或衣殼 ELISA 恢復沒有任何顯著影響，這由預測輪廓儀的近水平線表示。
右圖所示的負載 pH 值對衣殼恢復率或單體病毒也沒有顯著影響，後者也呈現近水平線。
DoE 建議的最佳條件是更高的負載密度、更短的停留時間以及在 pH 條件 A 下負載。
較短的停留時間也會加快製程速度，從而簡化 AAV 裝載階段。
負載 pH 條件 A 也是理想的，因為它不需要調整負載材料的 pH 值，從而節省了加載材料準備的時間。
利用 DoE 確定的這些最佳化負載條件，可以進行確認運行來驗證 DoE 輸出。一旦確認，這些最佳條件便可用於擴大規模生產，專門用於實現高品質、高純度、低雜質的 AAV 產品。
這種方法可以快速實現低資源需求和低成本評估，從而優化我們 Pharmaron 平台流程的捕捉色譜步驟。
總的來說，優化實驗只進行了三天。如果是實驗室規模，這將需要很多很多周才能完成，同時使用更多的 AAV 材料，並且由於一次只能運行一種條件，因此在擴大規模時相關的成本也會更高。
JMP軟體與我們的HTPD功能的結合使用，使我們能夠對平台流程進行強有力的優化，以滿足特定的基因治療產品需求。這大大加快了可行性和最佳化階段，這通常是流程開發路徑中最耗時的階段。最終，這大大縮短了從產品開發到成功將基因治療產品交付給診所患者所需的時間。
最後，我要感謝大家聆聽我的海報展示，希望大家能夠了解我們在Pharmaron所能做的事情，以及JMP在我們的產品開發途徑中的重要性。非常感謝。
