Pharmaron ha desarrollado un proceso de plataforma para generar terapias génicas con virus adenoasociados (AAV) con un conjunto de herramientas altamente adaptable para gestionar diferentes productos y serotipos de AAV. Nuestro conjunto de herramientas puede evaluar rápidamente la compatibilidad de un producto con nuestra plataforma a través de una evaluación de viabilidad de fabricación y ajustar con precisión una serie de parámetros para la optimización del proceso.
Una herramienta esencial para el enfoque de optimización de Pharmaron es el DOE (diseño de experimentos). Mostramos cómo un enfoque DOE compuesto central puede maximizar la recuperación de AAV monomérico al identificar el tiempo de residencia óptimo, la densidad de carga y el pH de carga para el paso de captura del proceso de purificación de AAV inicial. Las condiciones de carga óptimas se midieron utilizando el título por ELISA de cápside y dispersión de luz dinámica multiángulo (MADLS) y el porcentaje de monómero por DLS. El análisis DOE mostró una fuerte relación entre la densidad de carga y el contenido de monómero, por lo que una mayor densidad de carga resultó en un mayor rendimiento de virus monomérico. El pH de carga y el tiempo de residencia tuvieron efectos insignificantes en la recuperación y la monomericidad.
Dado que facilita el análisis de múltiples parámetros en una fracción del tiempo, el DOE ha permitido a Pharmaron identificar rápidamente las condiciones óptimas para la captura por afinidad. Mejora significativamente el rendimiento del proceso e impulsa la generación de un virus monomérico de alta pureza.
Hola, me llamo Damon Ho y soy científico asociado III en Pharmaron Biologics UK, con sede en Liverpool. Gracias por sintonizar esta charla. Estoy muy orgulloso de haber completado este trabajo durante mi pasantía estudiantil a través de la Universidad John Moores de Liverpool en Pharmaron Biologics. Y estoy aún más feliz de anunciar que JMP fue una parte importante del éxito de la optimización de nuestro paso de cromatografía de captura.
Pasando a la primera sección del póster, para presentar Pharmaron a aquellas personas que quizás no hayan oído hablar de nosotros antes, les diremos que somos un proveedor líder de servicios de investigación y desarrollo farmacéutico con operaciones en todo el mundo. En Liverpool, actualmente trabajamos en el desarrollo y la fabricación clínica de terapias génicas basadas en vectores virales, centrándonos actualmente en virus adenoasociados o AAV.
En Pharmaron, contamos con una plataforma de proceso impresionante que puede fabricar múltiples serotipos y productos de AAV, que se ilustra en la Figura 1.
Este proceso utiliza filtración profunda, seguida de cromatografía de captura, luego cromatografía de pulido intermedia, seguida de cromatografía de pulido, en nuestros pasos de formulación y, finalmente, filtración estéril.
Ahora, les presentaré nuestro robot y el uso de JMP. Estamos inmensamente orgullosos de compartir que tenemos un robot de desarrollo de procesos de alto rendimiento y última generación llamado Beckman Biomek i7, como pueden ver en la Figura 2 y la Figura 3, que puede evaluar rápidamente la adecuación de un producto a nuestra plataforma y, finalmente, ajustar los parámetros para su integración perfecta en nuestro proceso.
Al utilizar este robot para HTPD junto con el uso de JMP para DoE, podemos generar un producto farmacéutico de alto rendimiento y alta pureza en una fracción del tiempo en comparación con los métodos convencionales.
Este póster se centra en optimizar el paso de cromatografía de captura inicial en nuestro proceso de plataforma para un producto AAV.
Se diseñó un DoE utilizando el software JMP para determinar las condiciones óptimas de carga para el procesamiento. Se eligieron tres factores para optimizar: el tiempo de residencia, la densidad de carga y el pH de carga, y se midieron como resultados el título viral y la agregación viral.
Ahora, una breve información sobre cómo se diseñó el DoE en JMP. Se eligió un diseño compuesto central o CCD para crear el DoE por varias razones. En primer lugar, se requiere una cantidad mínima de combinaciones de factores para estimar los efectos principales y es capaz de analizar interacciones de dos factores y efectos cuadráticos.
El CCD también tiene una buena detección de falta de ajuste, que puede mostrar fácilmente qué factores afectan el resultado elegido, y el análisis gráfico es posible a través de varias herramientas disponibles en JMP, como se puede ver en todo el póster.
El CCD se creó en JMP seleccionando primero un diseño de superficie de respuesta, ingresando los nombres de los parámetros de pH de carga, densidad de carga y tiempo de residencia, y luego ingresando los rangos alto y bajo predefinidos. El objetivo era maximizar el contenido de virus monomérico y la recuperación de la cápside viral, por lo que estos se ingresan en la sección de respuestas.
El software es muy flexible y siempre se pueden añadir más respuestas al modelo final. En este caso, como se trataba de un CCD convencional, se seleccionó la opción de cara. Se seleccionaron mediciones por triplicado para el punto central. El CCD estaba entonces listo para generarse. En total, se generaron 17 condiciones experimentales diferentes a través del modelo CCD con diferentes parámetros bajos, medios y altos. Los puntos centrales se definen como todos los parámetros medios que forman la base del modelo CCD, y los parámetros bajos y altos actúan como sondas para probar cómo interactúan los factores y se influyen entre sí.
Esto forma una superficie de respuesta 3D que puede predecir con bastante precisión las interacciones de los factores. Con JMP, se pueden formular hipótesis sobre las condiciones finales y probarlas en una ejecución de confirmación posterior.
Nuestro robot HTPD se utilizó para realizar la cromatografía de captura a una escala muy pequeña, lo que permitió ejecutar múltiples condiciones al mismo tiempo, lo que habría llevado mucho más tiempo a escala de laboratorio. Este sistema permite un proceso altamente preciso y reproducible debido a su naturaleza automática.
Una vez que se ejecutaron todas las condiciones en la plataforma Biomek i7, empleamos el uso de nuestro análisis de clase mundial para medir el título de la cápside de AAV mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, un dualizador acortado y dispersión de luz dinámica de múltiples ángulos, también conocido como MADLS.
El contenido de virus monomérico se midió mediante dispersión de luz dinámica convencional o DLS. JMP no solo utiliza el diseño de un estudio experimental, sino también el análisis de resultados.
Una vez que se dispuso de los datos analíticos, se introdujeron en JMP y los datos se pudieron visualizar de distintas maneras, incluidas las contragráficas que se muestran en las figuras 4, 4a, 4b y 4c. Se ejecutó una simulación para generar decenas de miles de resultados virtuales que ayudan a construir un modelo optimizado y también a comparar con datos experimentales del mundo real para generar un nivel de confianza en el modelo. Esto se muestra en la figura 5.
Los gráficos de contorno resaltan el impacto de una mayor densidad de carga, que aumenta el contenido de monómero viral, que se muestra en la Figura 4a como marrón. Sin embargo, al analizar la recuperación de la cápside mediante ELISA, que se destaca en la Figura 4b, se demostró que una menor densidad de carga, que también se muestra en marrón aquí, genera el mayor rendimiento de la cápside. Esto fue cuestionado por los datos de MADLS que se muestran en la Figura 4c, que proporcionaron la evidencia para respaldar el impacto de una mayor densidad de carga para aumentar el contenido de monómero viral, que se muestra en marrón y en rojo y naranja aquí en esta esquina inferior derecha.
Una consideración importante es que MADLS no mide agregados, lo que confirma los hallazgos de DLS. El pH y el tiempo de residencia no tuvieron un impacto significativo en el título de la cápside ni en los resultados de MADLS o DLS, por lo que los gráficos de contorno no se incluyen en este póster.
Ahora podemos pasar a la interpretación de los hallazgos. Después de las tres condiciones de aprendizaje analizadas, la densidad de aprendizaje tuvo el impacto más significativo en la recuperación de la cápside y la naturaleza monomérica del AAV, lo que se visualiza mediante el pronunciado gradiente de la línea en el injerto izquierdo del perfilador predictivo que se muestra en la figura 6.
El tiempo de residencia que se muestra en el gráfico central no tuvo ningún impacto notable ni siquiera en la recuperación del virus monomérico o de la cápside mediante ELISA, lo que se indica mediante la línea casi horizontal del perfilador de predicción.
El pH de carga que se muestra en el gráfico de la derecha tampoco afectó significativamente la recuperación de la cápside o del virus monomérico, que también tiene una línea casi horizontal.
La condición óptima sugerida por el DoE es una mayor densidad de carga con un tiempo de residencia más corto y una carga en la condición de pH A. Este es un resultado ideal del modelo ya que con una mayor densidad de carga, se utilizan menos medios de cromatografía de captura para lograr la misma densidad de carga objetivo.
Un tiempo de residencia más corto también da como resultado un proceso más rápido, lo que agiliza la etapa de carga de AAV.
Cargar una condición de pH A también es ideal ya que no requiere ajuste de pH del material de carga, ahorrando así tiempo durante la preparación del material de carga.
Utilizando estas condiciones de carga optimizadas determinadas por el DoE, se puede realizar una ejecución de confirmación para verificar el resultado del DoE. Una vez confirmadas, estas condiciones óptimas se pueden utilizar en una ejecución a mayor escala, que está diseñada específicamente para lograr un producto AAV de alta calidad, alta pureza y baja impureza.
Este enfoque condujo a una evaluación rápida de baja demanda de recursos y bajo costo para optimizar nuestro paso de cromatografía de captura para nuestro proceso de plataforma Pharmaron.
En total, los experimentos de optimización se llevaron a cabo en solo tres días. Si se hubiera realizado a escala de laboratorio, se habrían necesitado muchas, muchas semanas para completarlo, además de utilizar mucho más material AAV y un costo mucho mayor asociado al aumento de la escala, ya que solo se puede ejecutar una condición a la vez.
El uso del software JMP junto con nuestras capacidades de HTPD nos permite optimizar de forma sólida el proceso de nuestra plataforma para adaptarlo a las necesidades específicas de los productos de terapia génica. Esto acelera enormemente las etapas de viabilidad y optimización, que suelen ser las fases que más tiempo llevan en el proceso de desarrollo. En definitiva, esto reduce drásticamente el tiempo que transcurre desde el desarrollo del producto hasta la entrega exitosa de un producto de terapia génica a un paciente en la clínica.
Me gustaría terminar agradeciéndoles por escuchar mi presentación en póster. Espero que hayan aprendido una o dos cosas sobre lo que podemos hacer en Pharmaron, además de la importancia de JMP en nuestro proceso de desarrollo de productos. Muchas gracias.
