Pharmaron 开发了一种平台工艺，用于生成腺相关病毒 (AAV) 基因疗法，并配备了高度自适应的工具箱来管理不同的 AAV 产品和血清型。我们的工具箱可以通过制造可行性评估快速评估产品与我们平台的兼容性，并微调一系列参数以进行有针对性的工艺优化。
Pharmaron 优化方法的一个重要工具是 DOE（实验设计）。我们展示了中心复合 DOE 方法如何通过确定初始 AAV 纯化过程捕获步骤的最佳停留时间、加载密度和加载 pH 值来最大限度地提高单体 AAV 的回收率。使用 Capsid ELISA 滴度和多角度动态光散射 (MADLS) 以及 DLS 单体百分比来测量最佳加载条件。DOE 分析显示加载密度和单体含量之间存在密切联系，即更高的加载密度可产生更高的单体病毒产量。加载 pH 值和停留时间对回收率和单体性的影响可以忽略不计。
大家好，我叫 Damon Ho，是 Pharmaron Biologics UK 的科学助理 III，工作地点在利物浦。感谢您收听本次演讲。我非常自豪能在利物浦约翰摩尔斯大学 Pharmaron Biologics 实习期间完成这项工作。更高兴的是，JMP 在我们捕获色谱步骤优化的成功中发挥了重要作用。
接下来是海报的第一部分。向那些可能以前没有听说过我们的人介绍一下 Pharmaron，我们是一家领先的药物研发服务提供商，业务遍布全球。在利物浦，我们目前致力于基于病毒载体的基因治疗开发和临床制造，目前专注于腺相关病毒或 AAV。
在 Pharmaron，我们拥有令人印象深刻的平台流程，可以生产多种 AAV 血清型和产品，如图 1 所示。
该过程利用深度过滤，然后进行捕获色谱法，然后进行中间抛光色谱法，然后进行抛光色谱法，进入我们的配方步骤，最后进行无菌过滤。
现在，我将向您介绍我们的机器人和 JMP 的使用。我们非常自豪地告诉大家，我们拥有一台最先进的高通量工艺开发机器人，名为 Beckman Biomek i7，如图 2 和图 3 所示，它可以快速评估产品与我们平台的契合度，并最终调整参数，使其无缝集成到我们的工艺中。
利用该机器人进行 HTPD 并结合使用 JMP 进行 DoE，我们可以在比传统方法更短的时间内生成高产量、高纯度的药物产品。
这张海报重点介绍了如何优化我们平台流程中针对 AAV 产品的初始捕获色谱步骤。
使用 JMP 软件设计了 DoE，以确定最佳的加工加载条件。选择了三个因素进行优化，即停留时间、加载密度和加载 pH，并以病毒滴度和病毒聚集作为输出进行测量。
现在，让我们快速了解一下 JMP 中 DoE 的设计方法。选择中心复合设计 (CCD) 来创建 DoE 有以下几个原因。首先，需要最少数量的因子组合来估计主效应，并且它能够分析双因子相互作用和二次效应。
CCD 还具有良好的拟合度检测能力，可以轻松显示哪些因素会影响所选结果，并且可以通过 JMP 中提供的各种工具进行图形分析，正如您在海报中看到的那样。
CCD 是在 JMP 中创建的，首先选择响应曲面设计，输入加载 pH、加载密度和停留时间的参数名称，然后输入预定义的高低范围。目标是最大化单体病毒含量和病毒衣壳回收率，因此这些都输入在响应部分。
该软件非常灵活，您始终可以在完成的模型中添加更多响应。在本例中，由于这是一个传统的 CCD，因此选择了面。为中心点选择了三次测量。然后就可以生成 CCD 了。总共通过 CCD 模型生成了 17 种不同的实验条件，具有不同的低、中、高参数。中心点定义为构成 CCD 模型基础的所有中等参数，低和高参数充当探针，以测试因素如何相互作用和影响彼此。
这形成了一个 3D 响应面，可以相当准确地预测因素之间的相互作用。然后可以使用 JMP 假设最终条件，并在随后的确认运行中进行测试。
我们的 HTPD 机器人用于在非常小的规模上执行捕获色谱分析，允许同时运行多个条件，这在实验室规模下会花费更长的时间。由于该系统具有自动化特性，因此可以实现高度准确且可重复的过程。
一旦所有条件都在 Biomek i7 平台上运行，我们就会利用我们世界一流的分析技术，通过酶联免疫吸附试验、缩短二元器和多角度动态光散射（也称为 MADLS）测量 AAV 衣壳滴度。
单体病毒含量通过常规动态光散射或 DLS 进行测量。JMP 不仅使用实验研究的设计，而且还在结果分析中使用。
一旦获得分析数据，就将其输入 JMP，并以多种不同的方式可视化数据，包括图 4、图 4a、4b 和 4c 中显示的对照图。运行模拟以生成数以万计的虚拟结果，这有助于构建优化模型，并与真实世界的实验数据进行比较，以建立模型的置信度。如图 5 所示。
等高线图突出显示了较高加载密度的影响，这会增加病毒单体含量，如图 4a 中的棕色所示。然而，在分析衣壳 ELISA 回收率（如图 4b 中突出显示）时，结果显示较低的加载密度（此处也显示为棕色）可获得最高的衣壳产量。图 4c 中显示的 MADLS 数据对此提出了质疑，它提供了证据来支持较高加载密度对增加病毒单体含量的影响，如图中的棕色以及右下角的红色和橙色所示。
一个重要的考虑因素是 MADLS 不测量聚集体，因此证实了 DLS 的发现。pH 和停留时间对衣壳滴度、MADLS 或 DLS 结果没有显著影响，因此本海报中未包含等高线图。
现在，我们可以继续解释研究结果。在分析了三种学习条件后，学习密度对衣壳恢复和 AAV 的单体性质具有最显著的影响，这可以通过图 6 中显示的预测分析器左侧移植物上的线的陡峭梯度来直观地看出。
中央图表中显示的停留时间对单体病毒或衣壳 ELISA 恢复没有任何显著影响，这由预测分析器的近水平线表示。
右图所示的加载 pH 值对衣壳恢复率或单体病毒也没有显著影响，后者也呈近水平线。
DoE 建议的最佳条件是更高的负载密度、更短的停留时间以及在 pH 条件 A 下负载。这是模型的理想结果，因为负载密度越高，使用更少的捕获层析介质即可实现相同的目标负载密度。
较短的停留时间也会加快过程速度，从而简化 AAV 装载阶段。
加载 pH 条件 A 也是理想的，因为它不需要调整加载材料的 pH 值，从而节省了加载材料准备的时间。
使用 DoE 确定的这些优化装载条件，然后可以进行确认运行以验证 DoE 输出。确认后，这些最佳条件可用于放大运行，该运行专门设计用于实现高质量、高纯度和低杂质的 AAV 产品。
这种方法可以快速实现低资源需求和低成本评估，从而优化我们 Pharmaron 平台流程的捕获色谱步骤。
总体而言，优化实验仅用了三天时间。如果是实验室规模，则需要花费很多很多周的时间才能完成，并且需要使用更多的 AAV 材料，而且由于一次只能运行一种条件，因此扩大规模时的成本也会更高。
将 JMP 软件与我们的 HTPD 功能结合使用，我们可以对平台流程进行稳健优化，以满足特定的基因治疗产品需求。这大大加快了可行性和优化阶段，而这两个阶段通常是流程开发路径中最耗时的阶段。最终，这大大缩短了从产品开发到成功将基因治疗产品交付给诊所患者所需的时间。
最后，我要感谢大家聆听我的海报展示，希望大家能够了解到 Pharmaron 可以做什么，以及 JMP 在我们的产品开发路径中的重要性。非常感谢。
