Pharmaron은 다양한 AAV 제품과 혈청형을 관리하기 위한 고도로 적응성 있는 툴박스를 사용하여 아데노 관련 바이러스(AAV) 유전자 요법을 생성하는 플랫폼 프로세스를 개발했습니다. 당사의 툴박스는 제조 타당성 평가를 통해 플랫폼과의 제품 호환성을 신속하게 평가하고, 타겟 프로세스 최적화를 위해 여러 매개변수를 미세 조정할 수 있습니다.
Pharmaron의 최적화 접근 방식에 필수적인 도구 중 하나는 DOE(실험 계획)입니다. 우리는 중앙 복합 DOE 접근 방식이 초기 AAV 정제 프로세스의 포집 단계에 대한 최적의 거주 시간, 로딩 밀도 및 로딩 pH를 식별하여 모노머 AAV의 회수를 극대화할 수 있는 방법을 보여줍니다. 최적의 로딩 조건은 Capsid ELISA 및 다중 각도 동적 광산란(MADLS)에 의한 적정 및 DLS에 의한 모노머 백분율을 사용하여 측정되었습니다. DOE 분석은 로딩 밀도와 모노머 함량 사이에 강력한 연관성을 보였으며, 로딩 밀도가 높을수록 모노머 바이러스의 수율이 높아졌습니다. 로딩 pH와 거주 시간은 회수 및 모노머성에 미치는 영향이 미미했습니다.
DOE는 여러 매개변수의 분석을 훨씬 짧은 시간에 용이하게 하기 때문에 Pharmaron이 친화력 캡처를 위한 최적의 조건을 빠르게 식별할 수 있도록 했습니다. 이는 공정 성능을 크게 개선하고 고순도 모노머 바이러스 생성을 촉진합니다.
안녕하세요, 저는 Damon Ho이고, Liverpool에 있는 Pharmaron Biologics UK의 Scientific Associate III입니다. 이 강연을 시청해 주셔서 감사합니다. Liverpool John Moores University에서 Pharmaron Biologics의 학생 인턴십을 통해 이 작업을 완료하게 되어 정말 자랑스럽습니다. 그리고 JMP가 캡처 크로마토그래피 단계 최적화의 성공에 큰 역할을 했다는 소식을 전하게 되어 더욱 기쁩니다.
포스터의 첫 번째 섹션으로 넘어갑니다. Pharmaron을 전에 들어보지 못했을 수 있는 사람들에게 소개하기 위해, 우리는 전 세계적으로 운영되는 선도적인 제약 연구 및 개발 서비스 제공업체입니다. 리버풀에서 우리는 현재 바이러스 벡터 기반 유전자 치료 개발 및 임상 제조를 진행하고 있으며, 현재는 아데노 연관 바이러스 또는 AAV에 집중하고 있습니다.
Pharmaron에서는 그림 1에 나타난 것처럼 다수의 AAV 세로타입과 제품을 제조할 수 있는 인상적인 플랫폼 프로세스를 보유하고 있습니다.
이 공정에서는 심층 여과, 그다음 포획 크로마토그래피, 그다음 중간 연마 크로마토그래피, 그다음 연마 크로마토그래피를 당사의 제형 단계에 적용한 후 마지막으로 멸균 여과를 실시합니다.
이제 저희 로봇과 JMP의 사용법을 소개해드리겠습니다. 그림 2와 그림 3에서 볼 수 있듯이, Beckman Biomek i7이라는 최첨단 고처리량 프로세스 개발 로봇을 보유하고 있다는 사실을 공유하게 되어 매우 자랑스럽습니다. 이 로봇은 제품이 저희 플랫폼에 적합한지 신속하게 평가하고, 마지막으로 프로세스에 완벽하게 통합되도록 매개변수를 조정할 수 있습니다.
DoE를 위한 JMP와 함께 HTPD를 위한 이 로봇을 활용함으로써, 기존 방식에 비해 훨씬 짧은 시간 안에 고수율, 고순도의 의약품을 생산할 수 있습니다.
이 포스터는 AAV 제품을 위한 플랫폼 프로세스에서 초기 포획 크로마토그래피 단계를 최적화하는 데 중점을 두고 있습니다.
DoE는 JMP 소프트웨어를 사용하여 가공을 위한 최적의 로딩 조건을 결정하기 위해 설계되었습니다. 최적화할 세 가지 요인이 선택되었는데, 이는 거주 시간, 로딩 밀도, 로딩 pH였으며, 바이러스 역가와 바이러스 응집은 출력으로 측정되었습니다.
이제 JMP에서 DoE가 어떻게 설계되었는지에 대한 간단한 정보를 알려드리겠습니다. 중심 합성 설계 또는 CCD는 여러 가지 이유로 DoE를 만드는 데 선택되었습니다. 첫째, 주효과를 추정하는 데 최소한의 요인 조합이 필요하고 2인자 상호작용과 2차 효과를 분석할 수 있기 때문입니다.
CCD는 적합성 부족 감지 기능이 뛰어나 선택한 결과에 영향을 미치는 요인을 쉽게 보여줄 수 있으며, 포스터 전체에서 볼 수 있듯이 JMP에서 제공하는 다양한 도구를 통해 그래픽 분석이 가능합니다.
CCD는 JMP에서 먼저 반응 표면 설계를 선택하고, 로딩 pH, 로딩 밀도, 체류 시간의 매개변수 이름을 입력한 다음, 미리 정의된 높은 범위와 낮은 범위를 입력하여 생성되었습니다. 목표는 모노머 바이러스 함량과 바이러스 캡시드 회수를 극대화하는 것이었으므로, 이것들은 응답 섹션에 입력됩니다.
소프트웨어는 매우 유연하며, 완성된 모델에 항상 더 많은 응답을 추가할 수 있습니다. 이 경우, 이는 기존 CCD였으므로, 표면이 선택되었습니다. 중심점에 대해 3회 측정이 선택되었습니다. 그런 다음 CCD를 생성할 준비가 되었습니다. 총 17개의 다른 실험 조건이 다양한 낮음, 중간 및 높음 매개변수를 사용하여 CCD 모델을 통해 생성되었습니다. 중심점은 CCD 모델의 기초를 형성하는 모든 중간 매개변수로 정의되며, 낮음 및 높음 매개변수는 요인이 서로 상호 작용하고 영향을 미치는 방식을 테스트하는 프로브 역할을 합니다.
이는 요인의 상호작용을 매우 정확하게 예측할 수 있는 3D 반응 표면을 형성합니다. JMP를 사용하면 궁극적인 조건을 가정하고 후속 확인 실행에서 테스트할 수 있습니다.
저희 HTPD 로봇은 매우 작은 규모에서 캡처 크로마토그래피를 수행하는 데 사용되어 여러 조건을 동시에 실행할 수 있었습니다. 실험실 규모에서는 훨씬 더 오래 걸렸을 것입니다. 이 시스템은 자동적 특성으로 인해 매우 정확하고 재현 가능한 프로세스를 가능하게 합니다.
모든 조건이 Biomek i7 플랫폼에서 실행된 후, 우리는 세계적인 수준의 분석 기술을 사용하여 효소 결합 면역 흡착 검사, 단축 듀얼라이저, 다중 각도 동적 광산란(MADLS라고도 함)을 통해 AAV 캡시드 역가를 측정했습니다.
모노머 바이러스 함량은 기존의 동적 광 산란 또는 DLS로 측정되었습니다. JMP는 실험 연구의 설계뿐만 아니라 결과 분석에도 사용됩니다.
분석 데이터가 사용 가능해지자, 이를 JMP에 입력하여 다양한 방식으로 시각화할 수 있게 했으며, 여기에는 그림 4, 그림 4a, 4b, 4c에 표시된 카운터 플롯이 포함됩니다. 수만 개의 가상 결과를 생성하기 위해 시뮬레이션을 실행하여 최적화된 모델을 구축하고 실제 실험 데이터와 비교하여 모델의 신뢰 수준을 구축했습니다. 이는 그림 5에 나와 있습니다.
등고선 플롯은 더 높은 로딩 밀도의 영향을 강조하는데, 이는 그림 4a에서 갈색으로 표시된 바이러스 단량체 함량을 증가시킵니다. 그러나 그림 4b에서 강조 표시된 캡시드 ELISA 회수를 분석한 결과, 여기에서도 갈색으로 표시된 낮은 로딩 밀도가 가장 높은 캡시드 수율을 반환하는 것으로 나타났습니다. 이는 그림 4c에 표시된 MADLS 데이터에 의해 도전을 받았는데, 이는 더 높은 로딩 밀도가 바이러스 단량체 함량을 증가시키는 영향을 뒷받침하는 증거를 제공했으며, 이는 이 오른쪽 하단 모서리에 갈색과 빨간색과 주황색으로 표시되었습니다.
중요한 고려 사항은 MADLS가 응집체를 측정하지 않는다는 것입니다. 따라서 DLS 결과를 확인합니다. pH와 체류 시간은 캡시드 역가, MADLS 또는 DLS 결과에 큰 영향을 미치지 않았으므로 이 포스터에는 등고선 플롯이 포함되지 않았습니다.
이제 우리는 발견 사항의 해석으로 넘어갈 수 있습니다. 분석된 세 가지 학습 조건 이후, 학습 밀도는 캡시드 회복과 AAV의 단량체적 특성에 가장 큰 영향을 미쳤으며, 이는 그림 6에 표시된 예측 프로파일러의 왼쪽 그래프트에 있는 선의 가파른 기울기로 시각화됩니다.
중앙 그래프에 표시된 체류 시간은 모노머 바이러스나 캡시드 ELISA 회수에 눈에 띄는 영향을 미치지 않았는데, 이는 예측 프로파일러의 거의 수평선으로 표시되어 있습니다.
오른쪽 그래프에 표시된 pH 로딩도 캡시드 회수율이나 모노머 바이러스에 큰 영향을 미치지 않는데, 이 역시 수평선에 가깝습니다.
DoE에서 제안한 최적 조건은 더 높은 로딩 밀도와 더 짧은 체류 시간, 그리고 pH 조건 A에서의 로딩입니다. 이는 더 높은 로딩 밀도에서 동일한 목표 로딩 밀도를 달성하기 위해 더 적은 포획 크로마토그래피 매체가 사용되므로 모델의 이상적인 결과입니다.
체류 시간이 짧을수록 프로세스도 빨라지고, AAV 로딩 단계도 간소화됩니다.
pH 조건 A를 적재하는 것은 적재 물질의 pH를 조정할 필요가 없으므로 적재 물질을 준비하는 데 걸리는 시간을 절약할 수 있으므로 이상적입니다.
DoE에서 결정한 이러한 최적화된 로딩 조건을 사용하여 DoE 출력을 검증하기 위한 확인 실행이 가능합니다. 확인되면 이러한 최적 조건을 확장된 실행에 사용할 수 있으며, 이는 고품질, 고순도 및 저불순도 AAV 제품을 달성하도록 특별히 설계되었습니다.
이러한 접근방식을 통해 Pharmaron 플랫폼 프로세스에 대한 포획 크로마토그래피 단계를 최적화하기 위한 빠르고 낮은 리소스 수요와 낮은 비용의 평가가 가능해졌습니다.
전체적으로 최적화 실험은 단 3일 동안 진행되었습니다. 실험실 규모라면 완료하는 데 몇 주가 걸렸을 것이고, AAV 소재를 훨씬 더 많이 사용했을 것이고, 한 번에 한 가지 조건만 실행할 수 있기 때문에 규모를 늘릴 때 관련 비용이 훨씬 더 많이 들었을 것입니다.
JMP 소프트웨어를 HTPD 기능과 함께 사용하면 특정 유전자 치료 제품 요구 사항에 맞게 플랫폼 프로세스를 강력하게 최적화할 수 있습니다. 이를 통해 프로세스 개발 경로에서 가장 시간이 많이 걸리는 단계인 실행 가능성 및 최적화 단계가 크게 단축됩니다. 궁극적으로 제품 개발에서 유전자 치료 제품을 클리닉 환자에게 성공적으로 제공하는 데 걸리는 시간이 크게 단축됩니다.
포스터 프레젠테이션을 들어주셔서 감사드리며, Pharmaron에서 할 수 있는 일과 제품 개발 경로에서 JMP의 중요성에 대해 몇 가지를 배웠으면 합니다. 대단히 감사합니다.
