Pharmaron は、さまざまな AAV 製品と血清型を管理するための高度に適応したツールボックスを使用して、アデノ随伴ウイルス (AAV) 遺伝子治療を生成するプラットフォーム プロセスを開発しました。当社のツールボックスは、製造実現可能性評価を通じて製品と当社のプラットフォームの互換性を迅速に評価し、ターゲットを絞ったプロセス最適化のために多数のパラメータを微調整できます。
Pharmaron の最適化アプローチに不可欠なツールの 1 つが DOE (実験計画法) です。中心となる複合 DOE アプローチにより、最初の AAV 精製プロセスの捕捉ステップに最適な滞留時間、負荷密度、負荷 pH を特定することで、モノマー AAV の回収率を最大化する方法を示します。最適な負荷条件は、カプシド ELISA と多角度動的光散乱 (MADLS) による力価と、DLS によるモノマーの割合を使用して測定されました。DOE 分析により、負荷密度とモノマー含有量の間に強い関連が示され、負荷密度が高いほどモノマーウイルスの収量が高くなりました。負荷 pH と滞留時間は、回収率とモノマー性にほとんど影響しませんでした。
DOE は、短時間で複数のパラメータの分析を容易にするため、Pharmaron 社が親和性捕捉の最適な条件を迅速に特定できるようにしました。これにより、プロセス パフォーマンスが大幅に向上し、高純度のモノマー ウイルスの生成が促進されます。
こんにちは。私はデイモン・ホーです。リバプールを拠点とする Pharmaron Biologics UK の Scientific Associate III です。この講演をお聞きいただきありがとうございます。リバプール・ジョン・ムーアズ大学で Pharmaron Biologics に学生として在籍中にこの研究を完了できたことを本当に誇りに思っています。そして、キャプチャークロマトグラフィー ステップの最適化の成功に JMP が大きな役割を果たしたことをお知らせできることをさらに嬉しく思います。
ポスターの最初のセクションに移ります。Pharmaron についてこれまで聞いたことのない方々にご説明すると、当社は世界規模で事業を展開する大手製薬研究開発サービス プロバイダーです。リバプールでは現在、ウイルス ベクター ベースの遺伝子治療の開発と臨床製造に取り組んでおり、現在はアデノ随伴ウイルス (AAV) に重点を置いています。
Pharmaron には、複数の AAV 血清型と製品を製造できる優れたプラットフォーム プロセスがあり、図 1 に示されています。
このプロセスでは、深層濾過、続いて捕捉クロマトグラフィー、中間ポリッシングクロマトグラフィー、ポリッシングクロマトグラフィーを経て、当社の製剤工程に進み、最後に滅菌濾過が行われます。
ここで、当社のロボットと JMP の使用についてご紹介します。当社は、Beckman Biomek i7 と呼ばれる最先端の高スループット プロセス開発ロボットを所有していることを非常に誇りに思っています。図 2 と図 3 でわかるように、このロボットは、製品が当社のプラットフォームに適合するかどうかを迅速に評価し、最終的にプロセスにシームレスに統合できるようにパラメータを調整できます。
このロボットを HTPD に使用し、JMP を DoE に使用することで、従来の方法に比べて短時間で、高収量、高純度の医薬品を生成できます。
このポスターは、AAV 製品のプラットフォーム プロセスにおける最初のキャプチャ クロマトグラフィー ステップの最適化に焦点を当てています。
JMP ソフトウェアを使用して DoE を設計し、処理に最適な負荷条件を決定しました。最適化の対象として、滞留時間、負荷密度、負荷 pH の 3 つの要素が選択され、出力としてウイルス力価とウイルス凝集が測定されました。
ここで、JMP で DoE がどのように設計されたかについて簡単に説明します。DoE を作成するために中心複合設計 (CCD) が選択された理由はいくつかあります。まず、主効果を推定するために必要な因子の組み合わせの数が最小限で済み、2 因子の相互作用と二次効果を分析できることです。
CCD には適合性の欠如を検出する機能も備わっており、選択された結果に影響を与える要因を簡単に示すことができます。また、ポスター全体でわかるように、JMP で利用できるさまざまなツールを通じてグラフィカルな分析が可能です。
CCD は、まず応答曲面設計を選択し、負荷 pH、負荷密度、滞留時間のパラメータ名を入力し、次に定義済みの高範囲と低範囲を入力して JMP で作成されました。目標は、モノマーウイルス含有量とウイルスカプシド回収率を最大化することだったので、これらは応答セクションに入力されています。
ソフトウェアは非常に柔軟で、完成したモデルにいつでも応答を追加できます。この例では、これは従来の CCD であるため、面が選択されました。中心点には 3 回の測定が選択されました。これで、CCD を生成する準備が整いました。合計で、さまざまな低、中、高のパラメータを持つ CCD モデルによって 17 の異なる実験条件が生成されました。中心点は、CCD モデルの基礎を形成するすべての中パラメータとして定義され、低パラメータと高パラメータは、要因がどのように相互作用し、影響し合うかをテストするためのプローブとして機能します。
これにより、因子の相互作用を非常に正確に予測できる 3D 応答面が形成されます。JMP を使用すると、最終的な条件を仮定し、その後の確認実行でテストすることができます。
当社の HTPD ロボットは、非常に小規模なキャプチャクロマトグラフィーを実行するために使用され、複数の条件を同時に実行できるようになりました。これは、ラボ規模ではかなり長い時間がかかります。このシステムは自動化されているため、非常に正確で再現性の高いプロセスが可能です。
すべての条件が Biomek i7 プラットフォームで実行された後、当社の世界クラスの分析技術を使用して、酵素結合免疫吸着法、短縮デュアライザー、および多角度動的光散乱 (MADLS とも呼ばれる) によって AAV カプシド力価を測定しました。
モノマーウイルス含有量は、従来の動的光散乱法 (DLS) によって測定されました。JMP は、実験研究の設計だけでなく、結果の分析にも使用されます。
分析データが利用可能になると、JMP に入力され、図 4、図 4a、4b、4c に示す対比プロットなど、さまざまな方法でデータを視覚化できるようになりました。シミュレーションを実行して、最適化されたモデルの構築に役立つ数万の仮想結果を生成するとともに、実際の実験データと比較してモデルの信頼度を構築しました。これを図 5 に示します。
等高線図は、図 4a で茶色で示されているように、ウイルスモノマー含有量が増加する高負荷密度の影響を強調しています。しかし、図 4b で強調表示されているカプシド ELISA 回収率を分析すると、ここでも茶色で示されている低負荷密度が最高のカプシド収量をもたらすことが示されました。これは、図 4c に示されている MADLS データによって疑問視され、このデータは、右下隅の茶色と赤とオレンジで示されているように、ウイルスモノマー含有量が増加する高負荷密度の影響を裏付ける証拠を提供しました。
重要な考慮事項は、MADLS は凝集体を測定しないため、DLS の調査結果を確認することです。pH と滞留時間はカプシド力価、MADLS、または DLS の結果に大きな影響を与えなかったため、等高線図はこのポスターには含まれていません。
さて、結果の解釈に移りましょう。分析された 3 つの学習条件の後、学習密度はカプシドの回復と AAV のモノマー性に最も大きな影響を与えました。これは、図 6 に示す予測プロファイラーの左側のグラフの線の急勾配によって視覚化されます。
中央のグラフに示されている滞留時間は、予測プロファイラーのほぼ水平な線で示されているように、モノマーウイルスまたはカプシド ELISA 回収にも顕著な影響を与えませんでした。
右のグラフに示されている負荷 pH も、カプシドの回復やモノマーウイルスに大きな影響を与えず、これもほぼ水平の線を示しています。
DoE によって提案された最適条件は、pH 条件 A で滞留時間を短くし、負荷密度を高めた状態です。負荷密度が高いほど、同じ目標負荷密度を達成するために使用する捕捉クロマトグラフィー メディアが少なくなるため、これはモデルの理想的な結果です。
滞留時間が短くなるとプロセスも高速化され、AAV のロード段階が効率化されます。
pH 条件 A でのロードも理想的です。ロード材料の pH 調整が不要なため、ロード材料の準備にかかる時間が節約されます。
DoE によって決定されたこれらの最適化されたロード条件を使用して、確認実行を行い、DoE 出力を検証することができます。確認されると、これらの最適条件は、高品質、高純度、低不純物の AAV 製品を実現するために特別に設計されたスケールアップ実行で使用できます。
このアプローチにより、Pharmaron プラットフォーム プロセスのキャプチャ クロマトグラフィー ステップを最適化するために、リソース需要が少なくコストの低い評価を迅速に実行できるようになりました。
最適化実験は合計でわずか 3 日間で行われました。ラボ規模であれば、完了までに何週間もかかっていたでしょう。また、一度に実行できる条件は 1 つだけなので、規模を拡大すると、より多くの AAV 材料が使用され、関連コストも大幅に高くなります。
JMP ソフトウェアを HTPD 機能と併用することで、特定の遺伝子治療製品のニーズに合わせてプラットフォーム プロセスを強力に最適化できます。これにより、プロセス開発経路で最も時間のかかる段階である実現可能性と最適化の段階が大幅にスピードアップします。最終的には、製品開発からクリニックで患者に遺伝子治療製品を正常に提供できるようになるまでの時間が大幅に短縮されます。
最後に、私のポスター発表を聞いてくださった皆様に感謝申し上げます。Pharmaron で何ができるか、また製品開発における JMP の重要性について少しでも学んでいただければ幸いです。ありがとうございました。
