Pharmaron ha sviluppato un processo di piattaforma per generare terapie geniche per virus adeno-associati (AAV) con una cassetta degli attrezzi altamente adattabile per gestire vari prodotti e sierotipi AAV. La nostra cassetta degli attrezzi può valutare rapidamente la compatibilità di un prodotto con la nostra piattaforma attraverso una valutazione di fattibilità di produzione e mettere a punto con precisione una serie di parametri per l'ottimizzazione mirata del processo.
Uno strumento essenziale per l'approccio di Pharmaron all'ottimizzazione è il DOE (design of experiments). Mostriamo come un approccio DOE composito centrale possa massimizzare il recupero di AAV monomerico identificando il tempo di residenza ottimale, la densità di carico e il pH di carico per la fase di cattura del processo di purificazione iniziale di AAV. Le condizioni di carico ottimali sono state misurate utilizzando il titolo tramite Capsid ELISA e multi-angle dynamic light scattering (MADLS) e la percentuale di monomero tramite DLS. L'analisi DOE ha mostrato un forte legame tra densità di carico e contenuto di monomero, per cui una maggiore densità di carico ha determinato una maggiore resa di virus monomerico. Il pH di carico e il tempo di residenza hanno avuto effetti trascurabili sul recupero e sulla monomericità.
Poiché facilita l'analisi di più parametri in una frazione del tempo, DOE ha permesso a Pharmaron di identificare rapidamente le condizioni ottimali per la cattura di affinità. Migliora significativamente le prestazioni del processo e guida la generazione di un virus monomerico altamente puro.
Salve, mi chiamo Damon Ho e sono uno Scientific Associate III presso Pharmaron Biologics UK, con sede a Liverpool. Grazie per aver seguito questo talk. Sono davvero orgoglioso di aver completato questo lavoro durante il mio tirocinio presso la Liverpool John Moores University presso Pharmaron Biologics. E sono ancora più felice di annunciare che JMP ha avuto un ruolo fondamentale nel successo dell'ottimizzazione della nostra fase di cromatografia di cattura.
Passiamo alla prima sezione del poster. Per presentare Pharmaron a chi potrebbe non aver mai sentito parlare di noi prima, siamo un fornitore leader di servizi di ricerca e sviluppo farmaceutico con attività in tutto il mondo. A Liverpool, lavoriamo attualmente allo sviluppo di terapie geniche basate su vettori virali e alla produzione clinica, concentrandoci attualmente sui virus adeno-associati o AAV.
Presso Pharmaron disponiamo di un processo di piattaforma impressionante in grado di produrre molteplici sierotipi e prodotti AAV, come illustrato nella Figura 1.
Questo processo utilizza la filtrazione di profondità, seguita dalla cromatografia di cattura, quindi dalla cromatografia di lucidatura intermedia, seguita dalla cromatografia di lucidatura, nelle nostre fasi di formulazione e, infine, dalla filtrazione sterile.
Ora, vi presenterò il nostro robot e l'uso di JMP. Siamo immensamente orgogliosi di condividere che abbiamo un robot di sviluppo di processo ad alta produttività all'avanguardia chiamato Beckman Biomek i7, come potete vedere nella Figura 2 e nella Figura 3, che può valutare rapidamente l'adattamento di un prodotto alla nostra piattaforma e infine regolare i parametri per la sua integrazione senza soluzione di continuità nel nostro processo.
Utilizzando questo robot per HTPD insieme all'uso di JMP per DoE, possiamo generare un prodotto farmaceutico ad alta resa e ad alta purezza in una frazione del tempo rispetto ai metodi convenzionali.
Questo poster si concentra sull'ottimizzazione della fase iniziale della cromatografia di cattura nel nostro processo di piattaforma per un prodotto AAV.
Un DoE è stato progettato utilizzando il software JMP per determinare le condizioni di carico ottimali per l'elaborazione. Sono stati scelti tre fattori da ottimizzare, ovvero il tempo di residenza, la densità di carico e il pH di carico, con il titolo virale e l'aggregazione virale da misurare come output.
Ora, per alcune informazioni rapide su come il DoE è stato progettato in JMP. Un design composito centrale, o CCD, è stato scelto per creare il DoE per una serie di motivi. In primo luogo, che è richiesto un numero minimo di combinazioni di fattori per stimare gli effetti principali, ed è in grado di analizzare interazioni a due fattori ed effetti quadratici.
Il CCD ha anche un buon rilevamento della mancanza di adattamento, che può mostrare facilmente quali fattori influenzano il risultato scelto; inoltre, l'analisi grafica è possibile tramite vari strumenti disponibili in JMP, come si può vedere nel poster.
Il CCD è stato creato in JMP selezionando prima un design di superficie di risposta, inserendo i nomi dei parametri di pH di caricamento, densità di caricamento e tempo di residenza, quindi inserendo gli intervalli alto e basso predefiniti. L'obiettivo era massimizzare il contenuto di virus monomerico e il recupero del capside virale, quindi questi sono inseriti nella sezione delle risposte.
Il software è molto flessibile e puoi sempre aggiungere altre risposte nel modello finito. In questo caso, poiché si trattava di un CCD convenzionale, è stato selezionato un volto. Sono state selezionate misurazioni triplicate per il punto centrale. Il CCD era quindi pronto per essere generato. In totale, sono state generate 17 diverse condizioni sperimentali tramite il modello CCD con parametri bassi, medi e alti variabili. I punti centrali sono definiti come tutti i parametri medi che costituiscono la base del modello CCD, con i parametri bassi e alti che agiscono come sonde per testare come i fattori interagiscono e si influenzano a vicenda.
Ciò forma una superficie di risposta 3D che può predire con una certa accuratezza le interazioni dei fattori. Utilizzando JMP, le condizioni finali possono quindi essere ipotizzate e testate in una successiva esecuzione di conferma.
Il nostro robot HTPD è stato utilizzato per eseguire la cromatografia di cattura su scala molto piccola, consentendo di eseguire più condizioni contemporaneamente, cosa che avrebbe richiesto molto più tempo su scala di laboratorio. Questo sistema consente un processo altamente accurato e riproducibile grazie alla sua natura automatica.
Una volta eseguite tutte le condizioni sulla piattaforma Biomek i7, abbiamo utilizzato i nostri sistemi di analisi di livello mondiale per misurare il titolo del capside dell'AAV mediante un saggio immunoenzimatico, un dualizzatore abbreviato e la diffusione dinamica della luce multiangolo, nota anche come MADLS.
Il contenuto di virus monomerico è stato misurato tramite la diffusione dinamica della luce convenzionale o DLS. JMP non solo sta utilizzando il design di uno studio sperimentale, ma anche nell'analisi dei risultati.
Una volta disponibili i dati analitici, questi sono stati inseriti in JMP con i dati visualizzabili in vari modi, inclusi i contrografici mostrati nella Figura 4, Figura 4a, 4b e 4c. È stata eseguita una simulazione per generare decine di migliaia di risultati virtuali che aiutano a costruire un modello ottimizzato e anche a confrontarli con dati sperimentali del mondo reale per costruire un livello di confidenza nel modello. Ciò è mostrato nella Figura 5.
I grafici di contorno evidenziano l'impatto di una maggiore densità di carico, che aumenta il contenuto di monomeri virali mostrato nella Figura 4a come marrone. Tuttavia, analizzando il recupero ELISA del capside, evidenziato nella Figura 4b, è emerso che una minore densità di carico, mostrata anche in marrone qui, restituisce la resa del capside più elevata. Ciò è stato messo in discussione dai dati MADLS mostrati nella Figura 4c, che hanno fornito le prove a supporto dell'impatto di una maggiore densità di carico per aumentare il contenuto di monomeri virali, mostrato come marrone e rosso e arancione qui in questo angolo in basso a destra.
Una considerazione importante è che MADLS non misura gli aggregati, confermando così i risultati di DLS. Ph e tempo di residenza non hanno avuto un impatto significativo sul titolo del capside, sui risultati di MADLS o DLS, quindi i grafici di contorno non sono inclusi in questo poster.
Ora, possiamo passare all'interpretazione dei risultati. Dopo le tre condizioni di apprendimento analizzate, la densità di apprendimento ha avuto l'impatto più significativo sul recupero del capside e sulla natura monomerica dell'AAV, che è visualizzata dal gradiente ripido della linea sull'innesto sinistro del profiler predittivo mostrato nella figura 6.
Il tempo di residenza mostrato nel grafico centrale non ha avuto alcun impatto degno di nota nemmeno sul recupero del virus monomerico o del capside mediante ELISA, come indicato dalla linea quasi orizzontale del profiler di previsione.
Anche il pH di caricamento mostrato nel grafico a destra non ha avuto un impatto significativo sul recupero del capside o sul virus monomerico, che presenta anch'esso una linea quasi orizzontale.
La condizione ottimale suggerita dal DoE è una densità di carico più elevata con un tempo di residenza più breve e un carico alla condizione di pH A. Questo è un risultato ideale del modello poiché con una densità di carico più elevata, viene utilizzato meno mezzo di cromatografia di cattura per ottenere la stessa densità di carico target.
Un tempo di residenza più breve si traduce anche in un processo più rapido, che semplifica la fase di caricamento dell'AAV.
Anche il caricamento di una condizione di pH A è ideale poiché non richiede la regolazione del pH del materiale di carico, risparmiando così tempo durante la preparazione del materiale di carico.
Utilizzando queste condizioni di carico ottimizzate determinate dal DoE, è possibile effettuare una corsa di conferma per verificare l'output del DoE. Una volta confermate, queste condizioni ottimali possono essere utilizzate in una corsa su scala maggiore, specificamente progettata per ottenere un prodotto AAV di alta qualità, elevata purezza e bassa impurità.
Questo approccio ha portato a una rapida valutazione della richiesta di risorse ridotte e dei costi ridotti per ottimizzare la nostra fase di cromatografia di cattura per il nostro processo di piattaforma Pharmaron.
In totale, gli esperimenti di ottimizzazione sono stati condotti in soli tre giorni. Ci sarebbero volute molte, molte settimane per completarli se si fosse trattato di una scala di laboratorio, oltre all'utilizzo di molto più materiale AAV e a costi molto più elevati associati all'aumento della scala, poiché è possibile eseguire solo una condizione alla volta.
L'uso del software JMP in tandem con le nostre capacità HTPD può consentirci di eseguire un'ottimizzazione robusta del nostro processo di piattaforma per soddisfare le esigenze specifiche del prodotto di terapia genica. Ciò velocizza notevolmente le fasi di fattibilità e ottimizzazione, che sono spesso le fasi più dispendiose in termini di tempo del percorso di sviluppo del processo. In definitiva, ciò riduce drasticamente il tempo impiegato dallo sviluppo del prodotto alla consegna con successo di un prodotto di terapia genica a un paziente in clinica.
Vorrei concludere ringraziandovi per aver ascoltato la mia presentazione poster, e spero che abbiate imparato una cosa o due su cosa possiamo fare in Pharmaron, oltre all'importanza di JMP nel nostro percorso di sviluppo prodotto. Grazie mille.
