Pharmaron hat einen Plattformprozess zur Generierung von Gentherapien für Adeno-assoziierte Viren (AAV) mit einer hochadaptiven Toolbox zur Handhabung unterschiedlicher AAV-Produkte und Serotypen entwickelt. Unsere Toolbox kann die Kompatibilität eines Produkts mit unserer Plattform durch eine Machbarkeitsbewertung der Herstellung schnell beurteilen und eine Reihe von Parametern für eine gezielte Prozessoptimierung fein abstimmen.
Ein wesentliches Werkzeug für Pharmarons Optimierungsansatz ist DOE (Design of Experiments). Wir zeigen, wie ein zentraler zusammengesetzter DOE-Ansatz die Rückgewinnung von monomerem AAV maximieren kann, indem die optimale Verweilzeit, Beladungsdichte und der optimale pH-Wert für den Erfassungsschritt des anfänglichen AAV-Reinigungsprozesses ermittelt werden. Die optimalen Beladungsbedingungen wurden mithilfe des Titers durch Capsid-ELISA und der dynamischen Mehrwinkel-Lichtstreuung (MADLS) und des Monomeranteils durch DLS gemessen. Die DOE-Analyse zeigte einen starken Zusammenhang zwischen Beladungsdichte und Monomergehalt, wobei eine höhere Beladungsdichte zu einer höheren Ausbeute an monomerem Virus führte. Der pH-Wert der Beladung und die Verweilzeit hatten vernachlässigbare Auswirkungen auf Rückgewinnung und Monomerität.
Da DOE die Analyse mehrerer Parameter in einem Bruchteil der Zeit ermöglicht, konnte Pharmaron damit schnell die optimalen Bedingungen für die Affinitätserfassung ermitteln. Es verbessert die Prozessleistung erheblich und fördert die Erzeugung eines hochreinen, monomeren Virus.
Hallo, mein Name ist Damon Ho und ich bin Scientific Associate III bei Pharmaron Biologics UK mit Sitz in Liverpool. Vielen Dank, dass Sie sich diesen Vortrag angehört haben. Ich bin wirklich stolz, diese Arbeit während meines Praktikums an der Liverpool John Moores University bei Pharmaron Biologics abgeschlossen zu haben. Und ich freue mich noch mehr, Ihnen mitteilen zu können, dass JMP einen großen Anteil am Erfolg der Optimierung unseres Capture-Chromatographie-Schritts hatte.
Kommen wir zum ersten Abschnitt des Posters. Um Pharmaron Personen vorzustellen, die vielleicht noch nie von uns gehört haben: Wir sind ein führender Anbieter von pharmazeutischen Forschungs- und Entwicklungsdienstleistungen mit weltweiten Niederlassungen. In Liverpool arbeiten wir derzeit an der Entwicklung und klinischen Herstellung viraler vektorbasierter Gentherapien, wobei wir uns derzeit auf Adeno-assoziierte Viren oder AAVs konzentrieren.
Bei Pharmaron verfügen wir über einen beeindruckenden Plattformprozess, mit dem mehrere AAV-Serotypen und -Produkte hergestellt werden können, wie in Abbildung 1 dargestellt.
Bei diesem Verfahren kommt eine Tiefenfiltration zum Einsatz, gefolgt von einer Capture-Chromatographie, einer Zwischen-Polishing-Chromatographie, einer Polier-Chromatographie, unseren Formulierungsschritten und schließlich einer Sterilfiltration.
Jetzt stelle ich Ihnen unseren Roboter und die Verwendung von JMP vor. Wir sind unglaublich stolz darauf, Ihnen mitteilen zu können, dass wir einen hochmodernen Hochdurchsatz-Prozessentwicklungsroboter namens Beckman Biomek i7 haben, wie Sie in Abbildung 2 und Abbildung 3 sehen können. Dieser kann die Eignung eines Produkts für unsere Plattform schnell beurteilen und schließlich die Parameter für seine nahtlose Integration in unseren Prozess anpassen.
Durch die Nutzung dieses Roboters für HTPD und JMP für DoE können wir im Vergleich zu herkömmlichen Methoden in einem Bruchteil der Zeit ein ertragreiches, hochreines Arzneimittelprodukt erzeugen.
Dieses Poster konzentriert sich auf die Optimierung des ersten Capture-Chromatographie-Schritts in unserem Plattformprozess für ein AAV-Produkt.
Mithilfe der JMP-Software wurde ein DoE entwickelt, um die optimalen Ladebedingungen für die Verarbeitung zu ermitteln. Zur Optimierung wurden drei Faktoren ausgewählt: Verweilzeit, Ladedichte und Lade-pH-Wert. Als Ergebnisse wurden Virustiter und Virusaggregation gemessen.
Nun einige kurze Informationen dazu, wie das DoE in JMP entworfen wurde. Aus mehreren Gründen wurde für die Erstellung des DoE ein zentrales zusammengesetztes Design (CCD) gewählt. Erstens, weil zur Schätzung der Haupteffekte nur eine minimale Anzahl von Faktorkombinationen erforderlich ist und Zwei-Faktor-Interaktionen und quadratische Effekte analysiert werden können.
Das CCD verfügt außerdem über eine gute Anpassungserkennung, mit der leicht angezeigt werden kann, welche Faktoren das gewählte Ergebnis beeinflussen. Wie Sie auf dem gesamten Poster sehen können, ist eine grafische Analyse mithilfe verschiedener in JMP verfügbarer Tools möglich.
Das CCD wurde in JMP erstellt, indem zunächst ein Response Surface-Design ausgewählt, die Parameternamen für Lade-pH, Ladedichte und Verweilzeit eingegeben und dann die vordefinierten hohen und niedrigen Bereiche eingegeben wurden. Das Ziel bestand darin, den monomeren Virusgehalt und die Viruskapsidgewinnung zu maximieren, daher werden diese im Abschnitt „Reaktionen“ eingegeben.
Die Software ist sehr flexibel und Sie können dem fertigen Modell jederzeit weitere Antworten hinzufügen. In diesem Fall wurde „on face“ ausgewählt, da es sich um ein herkömmliches CCD handelte. Für den Mittelpunkt wurden dreifache Messungen ausgewählt. Das CCD war dann bereit zur Generierung. Insgesamt wurden über das CCD-Modell 17 verschiedene Versuchsbedingungen mit unterschiedlichen niedrigen, mittleren und hohen Parametern generiert. Als Mittelpunkte werden alle mittleren Parameter definiert, die die Grundlage des CCD-Modells bilden, wobei die niedrigen und hohen Parameter als Sonden dienen, um zu testen, wie die Faktoren interagieren und sich gegenseitig beeinflussen.
Dadurch entsteht eine 3D-Antwortfläche, mit der sich die Wechselwirkungen der Faktoren recht genau vorhersagen lassen. Mithilfe von JMP können dann Hypothesen über die endgültigen Bedingungen aufgestellt und diese in einem anschließenden Bestätigungslauf getestet werden.
Unser HTPD-Roboter wurde verwendet, um die Capture-Chromatographie in sehr kleinem Maßstab durchzuführen, sodass mehrere Bedingungen gleichzeitig ausgeführt werden konnten, was im Labormaßstab erheblich länger gedauert hätte. Dieses System ermöglicht aufgrund seiner automatischen Natur einen hochpräzisen und reproduzierbaren Prozess.
Nachdem alle Bedingungen auf der Biomek i7-Plattform ausgeführt wurden, nutzten wir unsere erstklassige Analytik, um den AAV-Kapsidtiter mittels eines Enzymimmunoassays, eines verkürzten Dualizers und der Mehrwinkel-dynamischen Lichtstreuung (auch bekannt als MADLS) zu messen.
Der Gehalt an monomeren Viren wurde mittels konventioneller dynamischer Lichtstreuung (DLS) gemessen. JMP wird nicht nur für die Gestaltung einer experimentellen Studie verwendet, sondern auch für die Analyse der Ergebnisse.
Sobald analytische Daten verfügbar waren, wurden diese in JMP eingegeben. Die Daten konnten auf verschiedene Weise visualisiert werden, einschließlich der in Abbildung 4, Abbildung 4a, 4b und 4c angezeigten Gegendiagramme. Es wurde eine Simulation ausgeführt, um Zehntausende virtuelle Ergebnisse zu generieren, die beim Erstellen eines optimierten Modells helfen und auch beim Vergleich mit realen experimentellen Daten, um ein Vertrauensniveau in das Modell aufzubauen. Dies ist in Abbildung 5 dargestellt.
Die Konturdiagramme verdeutlichen die Auswirkungen einer höheren Beladungsdichte, die den viralen Monomergehalt erhöht, wie in Abbildung 4a in Braun dargestellt. Bei der Analyse der Kapsid-ELISA-Rückgewinnung, die in Abbildung 4b hervorgehoben ist, zeigte sich jedoch, dass eine niedrigere Beladungsdichte, hier ebenfalls in Braun dargestellt, die höchste Kapsidausbeute liefert. Dies wurde durch MADLS-Daten in Frage gestellt, die in Abbildung 4c dargestellt sind und den Beweis dafür liefern, dass eine höhere Beladungsdichte den viralen Monomergehalt erhöht, wie in Braun und Rot und Orange hier in der unteren rechten Ecke dargestellt.
Ein wichtiger Aspekt ist, dass MADLS keine Aggregate misst und somit DLS-Ergebnisse bestätigt. pH-Wert und Verweilzeit hatten keinen signifikanten Einfluss auf Kapsid-Titer, MADLS- oder DLS-Ergebnisse, daher sind die Konturdiagramme nicht in diesem Poster enthalten.
Nun können wir mit der Interpretation der Ergebnisse fortfahren. Nach der Analyse der drei Lernbedingungen hatte die Lerndichte den größten Einfluss auf die Kapsiderholung und die monomere Natur des AAV, was durch den steilen Gradienten der Linie im linken Graft des in Abbildung 6 gezeigten prädiktiven Profilers visualisiert wird.
Die im zentralen Diagramm dargestellte Verweilzeit hatte keinen nennenswerten Einfluss auf die ELISA-Rückgewinnung selbst von monomeren Viren oder Kapsiden, was durch die nahezu horizontale Linie des Vorhersageprofilers angezeigt wird.
Der im rechten Diagramm dargestellte Lade-pH-Wert hatte ebenfalls keinen signifikanten Einfluss auf die Kapsidrückgewinnung oder das monomere Virus, das ebenfalls eine nahezu horizontale Linie aufweist.
Der vom DoE vorgeschlagene optimale Zustand ist eine höhere Ladedichte bei kürzerer Verweilzeit und Beladung bei pH-Bedingung A. Dies ist ein ideales Ergebnis des Modells, da bei einer höheren Ladedichte weniger Erfassungschromatographiemedium verwendet wird, um die gleiche Zielladedichte zu erreichen.
Eine kürzere Verweilzeit führt auch zu einem schnelleren Prozess, was die AAV-Ladephase rationalisiert.
Das Laden unter pH-Bedingung A ist auch ideal, da hierbei keine pH-Anpassung des Ladematerials erforderlich ist und somit bei der Vorbereitung des Ladematerials Zeit gespart wird.
Mithilfe dieser optimierten, vom DoE ermittelten Ladebedingungen kann dann ein Bestätigungslauf durchgeführt werden, um die DoE-Ausgabe zu verifizieren. Nach der Bestätigung können diese optimalen Bedingungen dann in einem hochskalierten Lauf verwendet werden, der speziell darauf ausgelegt ist, ein AAV-Produkt mit hoher Qualität, hoher Reinheit und geringer Verunreinigung zu erzielen.
Dieser Ansatz führte zu einer schnellen Bewertung mit geringem Ressourcenbedarf und geringen Kosten zur Optimierung unseres Capture-Chromatographie-Schritts für unseren Pharmaron-Plattformprozess.
Insgesamt dauerten die Optimierungsexperimente nur drei Tage. Im Labormaßstab hätte dies viele, viele Wochen gedauert. Außerdem hätte eine Vergrößerung des Maßstabs viel mehr AAV-Material verbraucht und die Kosten wären deutlich höher gewesen, da immer nur eine Bedingung gleichzeitig ausgeführt werden kann.
Durch die Verwendung der JMP-Software in Verbindung mit unseren HTPD-Funktionen können wir unseren Plattformprozess robust optimieren, um ihn an die spezifischen Anforderungen an Gentherapieprodukte anzupassen. Dadurch werden die Durchführbarkeits- und Optimierungsphasen erheblich beschleunigt, die häufig die zeitaufwändigsten Phasen des Prozessentwicklungspfads sind. Letztendlich verkürzt sich dadurch die Zeitspanne von der Produktentwicklung bis zur erfolgreichen Auslieferung eines Gentherapieprodukts an einen Patienten in der Klinik erheblich.
Zum Schluss möchte ich Ihnen dafür danken, dass Sie sich meine Posterpräsentation angehört haben. Ich hoffe, Sie haben ein oder zwei Dinge darüber gelernt, was wir bei Pharmaron tun können, und auch über die Bedeutung von JMP in unserem Produktentwicklungspfad. Vielen Dank.
