Pharmaron a développé une plateforme de processus permettant de générer des thérapies géniques à base de virus adéno-associés (AAV) avec une boîte à outils hautement adaptative permettant de gérer différents produits et sérotypes AAV. Notre boîte à outils permet d'évaluer rapidement la compatibilité d'un produit avec notre plateforme grâce à une évaluation de la faisabilité de la fabrication et d'affiner un certain nombre de paramètres pour une optimisation ciblée du processus.
L'un des outils essentiels de l'approche d'optimisation de Pharmaron est le DOE (plan d'expériences). Nous montrons comment une approche DOE composite centrale peut maximiser la récupération de l'AAV monomère en identifiant le temps de séjour optimal, la densité de chargement et le pH de charge pour l'étape de capture du processus initial de purification de l'AAV. Les conditions de chargement optimales ont été mesurées à l'aide du titre par ELISA Capsid et de la diffusion dynamique de la lumière multi-angle (MADLS) et du pourcentage de monomère par DLS. L'analyse DOE a montré un lien étroit entre la densité de chargement et la teneur en monomère, une densité de chargement plus élevée entraînant un rendement plus élevé de virus monomère. Le pH de charge et le temps de séjour ont eu des effets négligeables sur la récupération et la monoméricité.
En facilitant l'analyse de plusieurs paramètres en une fraction du temps, le DOE a permis à Pharmaron d'identifier rapidement les conditions optimales pour la capture par affinité. Il améliore considérablement les performances du processus et permet la génération d'un virus monomère extrêmement pur.
Bonjour, je m'appelle Damon Ho et je suis associé scientifique III chez Pharmaron Biologics UK, basé à Liverpool. Merci d'avoir écouté cette conférence. Je suis vraiment fier d'avoir réalisé ce travail lors de mon stage d'étudiant à l'Université John Moores de Liverpool chez Pharmaron Biologics. Et encore plus heureux d'annoncer que JMP a joué un rôle majeur dans le succès de l'optimisation de notre étape de chromatographie de capture.
Passons maintenant à la première partie de l'affiche. Pour présenter Pharmaron aux personnes qui n'auraient peut-être jamais entendu parler de nous, nous sommes un fournisseur de services de recherche et développement pharmaceutique de premier plan avec des opérations dans le monde entier. À Liverpool, nous travaillons actuellement sur le développement de thérapies géniques à base de vecteurs viraux et sur la fabrication clinique, en nous concentrant actuellement sur les virus adéno-associés ou AAV.
Chez Pharmaron, nous disposons d’une plateforme de processus impressionnante qui permet de fabriquer plusieurs sérotypes et produits AAV, comme l’illustre la figure 1.
Ce processus utilise une filtration en profondeur, suivie d'une chromatographie de capture, puis d'une chromatographie de polissage intermédiaire, suivie d'une chromatographie de polissage, jusqu'à nos étapes de formulation et enfin, d'une filtration stérile.
Je vais maintenant vous présenter notre robot et l'utilisation de JMP. Nous sommes extrêmement fiers de vous annoncer que nous disposons d'un robot de développement de processus à haut rendement de pointe appelé Beckman Biomek i7, comme vous pouvez le voir sur les figures 2 et 3, qui peut évaluer rapidement l'adéquation d'un produit à notre plateforme et enfin ajuster les paramètres pour son intégration transparente dans notre processus.
En utilisant ce robot pour HTPD ainsi que l'utilisation de JMP pour DoE, nous pouvons générer un produit médicamenteux à haut rendement et à haute pureté en une fraction du temps par rapport aux méthodes conventionnelles.
Cette affiche se concentre sur l’optimisation de l’étape initiale de chromatographie de capture dans notre processus de plateforme pour un produit AAV.
Un DoE a été conçu à l'aide du logiciel JMP pour déterminer les conditions de chargement optimales pour le traitement. Trois facteurs ont été choisis pour être optimisés, à savoir le temps de séjour, la densité de chargement et le pH de chargement, avec le titre viral et l'agrégation virale à mesurer comme résultats.
Maintenant, quelques informations rapides sur la manière dont le DoE a été conçu dans JMP. Un plan composite central, ou CCD, a été choisi pour créer le DoE pour un certain nombre de raisons. Tout d'abord, un nombre minimal de combinaisons de facteurs est requis pour estimer les effets principaux, et il est capable d'analyser les interactions à deux facteurs et les effets quadratiques.
Le CCD dispose également d'une bonne détection du manque d'ajustement, qui peut facilement montrer quels facteurs affectent le résultat choisi, et une analyse graphique est possible grâce à divers outils disponibles dans JMP, comme vous pouvez le voir tout au long de l'affiche.
Le CCD a été créé dans JMP en sélectionnant d'abord une surface de réponse, en saisissant les noms des paramètres de pH de chargement, de densité de chargement et de temps de séjour, puis en saisissant les plages hautes et basses prédéfinies. L'objectif était de maximiser la teneur en virus monomère et la récupération de la capside virale, ces informations sont donc saisies dans la section des réponses.
Le logiciel est très flexible et vous pouvez toujours ajouter d'autres réponses dans le modèle fini. Dans ce cas, comme il s'agissait d'un CCD conventionnel, une face a été sélectionnée. Des mesures en triple ont été sélectionnées pour le point central. Le CCD était alors prêt à être généré. Au total, 17 conditions expérimentales différentes ont été générées via le modèle CCD avec différents paramètres faibles, moyens et élevés. Les points centraux sont définis comme tous les paramètres moyens qui constituent la base du modèle CCD, les paramètres faibles et élevés agissant comme des sondes pour tester la manière dont les facteurs interagissent et s'influencent mutuellement.
Cela forme une surface de réponse 3D qui peut prédire avec assez de précision les interactions des facteurs. À l'aide de JMP, les conditions ultimes peuvent ensuite être émises et testées lors d'une exécution de confirmation ultérieure.
Notre robot HTPD a été utilisé pour effectuer la chromatographie de capture à très petite échelle, ce qui permet d'exécuter plusieurs conditions en même temps, ce qui aurait pris beaucoup plus de temps à l'échelle du laboratoire. Ce système permet un processus très précis et reproductible en raison de sa nature automatique.
Une fois toutes les conditions exécutées sur la plateforme Biomek i7, nous avons utilisé nos analyses de classe mondiale pour mesurer le titre de capside AAV par un test immuno-enzymatique, un dualiseur raccourci et une diffusion dynamique de la lumière multi-angle, également connue sous le nom de MADLS.
La teneur en virus monomériques a été mesurée par diffusion dynamique de la lumière conventionnelle ou DLS. JMP utilise non seulement la conception d'une étude expérimentale, mais aussi l'analyse des résultats.
Une fois les données analytiques disponibles, elles ont été saisies dans JMP et les données ont pu être visualisées de différentes manières, notamment sous forme de contre-graphiques affichés dans la Figure 4, la Figure 4a, la Figure 4b et la Figure 4c. Une simulation a été exécutée pour générer des dizaines de milliers de résultats virtuels qui aident à construire un modèle optimisé et également à comparer avec des données expérimentales réelles pour établir un niveau de confiance dans le modèle. Ceci est illustré dans la Figure 5.
Les courbes de niveau mettent en évidence l'impact d'une densité de chargement plus élevée, qui augmente la teneur en monomères viraux, comme le montre la figure 4a en marron. Cependant, après analyse de la récupération ELISA de la capside, qui est mise en évidence dans la figure 4b, il a été démontré qu'une densité de chargement plus faible, également indiquée en marron ici, donne le rendement de capside le plus élevé. Cela a été contesté par les données MADLS présentées dans la figure 4c, qui ont fourni la preuve à l'appui de l'impact d'une densité de charge plus élevée sur l'augmentation de la teneur en monomères viraux, indiquée en marron et en rouge et orange ici dans le coin inférieur droit.
Il est important de noter que le MADLS ne mesure pas les agrégats, ce qui confirme les résultats du DLS. Le pH et le temps de séjour n'ont pas eu d'impact significatif sur le titre de capside, les résultats du MADLS ou du DLS, de sorte que les courbes de niveau ne sont pas incluses dans cette affiche.
Nous pouvons maintenant passer à l'interprétation des résultats. Après les trois conditions d'apprentissage analysées, la densité d'apprentissage a eu l'impact le plus significatif sur la récupération de la capside et la nature monomérique de l'AAV, ce qui est visualisé par le gradient prononcé de la ligne sur la greffe gauche du profileur prédictif illustré à la figure 6.
Le temps de séjour indiqué dans le graphique central n'a pas eu d'impact notable sur la récupération du virus monomère ou de la capside ELISA, ce qui est indiqué par la ligne presque horizontale du profileur de prédiction.
Le pH de chargement indiqué dans le graphique de droite n'a pas non plus eu d'impact significatif sur la récupération de la capside ou du virus monomère, qui présente également une ligne presque horizontale.
La condition optimale suggérée par le DoE est une densité de chargement plus élevée avec un temps de séjour plus court et un chargement à la condition de pH A. Il s'agit d'un résultat idéal du modèle car avec une densité de chargement plus élevée, moins de supports de chromatographie de capture sont utilisés pour atteindre la même densité de chargement cible.
Un temps de séjour plus court se traduit également par un processus plus rapide, ce qui rationalise l'étape de chargement de l'AAV.
Le chargement dans une condition de pH A est également idéal car il ne nécessite pas d'ajustement du pH du matériau de charge, ce qui permet de gagner du temps lors de la préparation du matériau de charge.
En utilisant ces conditions de chargement optimisées déterminées par le DoE, une exécution de confirmation peut ensuite être effectuée pour vérifier les résultats du DoE. Une fois confirmées, ces conditions optimales peuvent ensuite être utilisées dans une exécution à plus grande échelle, spécialement conçue pour obtenir un produit AAV de haute qualité, de haute pureté et à faible teneur en impuretés.
Cette approche a conduit à une évaluation rapide à faible demande de ressources et à faible coût pour optimiser notre étape de chromatographie de capture pour notre processus de plateforme Pharmaron.
Au total, les expériences d'optimisation se sont déroulées sur trois jours seulement. Cela aurait pris de nombreuses semaines à l'échelle du laboratoire, avec une utilisation de beaucoup plus de matériel AAV et des coûts beaucoup plus élevés associés à l'augmentation de l'échelle, car une seule condition peut être exécutée à la fois.
L'utilisation du logiciel JMP en tandem avec nos capacités HTPD peut nous permettre d'effectuer une optimisation robuste de notre processus de plateforme pour répondre aux besoins spécifiques des produits de thérapie génique. Cela accélère considérablement les étapes de faisabilité et d'optimisation, qui sont souvent les phases les plus chronophages du processus de développement. En fin de compte, cela réduit considérablement le temps nécessaire entre le développement du produit et la livraison réussie d'un produit de thérapie génique à un patient en clinique.
Je voudrais terminer en vous remerciant d'avoir écouté ma présentation par affiches. J'espère que vous avez appris une chose ou deux sur ce que nous pouvons faire chez Pharmaron, ainsi que sur l'importance de JMP dans notre parcours de développement de produits. Merci beaucoup.
