バイオ医薬品業界では、培地成分のスクリーニングにマイクロプレートリーダーを用いた微生物増殖アッセイが一般的に用いられています。これらのアッセイは大量のデータを非常に短時間で生成するため、データ分析ステップのボトルネックを解消する自動化手法は、より迅速な意思決定を可能にする上で不可欠です。ケリー社では、増殖アッセイデータの取得、クリーニング、フォーマット化は手作業で行われており、時間と手間がかかり、エラーも発生しやすい状況です。
本研究では、データフォーマット、クリーンアップ、および可視化を自動化することでデータ分析手法を改善する一連のスクリプトを作成しました。JMPのワークフロービルダーとアドインビルダーを使用してスクリプトをキャプチャし、ハイスループット微生物増殖アッセイにおけるデータ分析時間の短縮と冗長な分析の自動化を実現する、使いやすいクリックベースのアプローチを作成しました。アドインにより、生データファイル1つあたりのデータ分析時間が20分から4分へと80%短縮されました。これらのアドインは、ハイスループットマイクロタイタープレートアッセイにおけるデータ取得、クリーンアップ、および分析のボトルネックを解消する必要のある他のJMPユーザー向けに公開される予定です。
はい、こんにちは。カイル・プロブストと申します。私はケリー社のシニアサイエンティストで、北米本社のあるウィスコンシン州ベロイトを拠点に活動しています。本日は、微生物の増殖特性評価を自動化するためのJMPアドインビルダーの使用方法についてご説明いたします。私はJMPを約8年間使用しており、今回がディスカバリーサミットでの初発表となるため、大変楽しみにしています。
本日お話しする内容の概要を簡単にご説明します。まず、この研究を行った理由、その重要性、目的、そして具体的に目指していたことについて説明し、次に、ケリー社、製薬細胞栄養学、微生物増殖アッセイとは何か、その実施方法、そして既存のデータ分析手法について少し背景情報をお伝えします。その後、本題に入り、アドイン自体のデモを行い、今回の研究内容を明確にご説明します。最後に、結論を述べます。
わかりました。原料と培地栄養素のスクリーニングは、バイオプロセス開発において重要なステップです。製薬業界では、マイクロプレートリーダーを用いたハイスループットスクリーニングアッセイ（HTSアッセイ）が一般的に用いられています。これらのアッセイは、非常に短時間で大量のデータを生成できます。そのため、データの処理と分析がボトルネックとなっています。
ボトルネックとなっているデータ分析ステップを自動化することは、意思決定の迅速化に不可欠です。特に業界では、時間は金なり、ということは周知の事実です。ケリー社では、HTSアッセイデータの取得、クリーニング、フォーマット化は手作業で行われており、非常に時間がかかり、エラーも発生しやすいプロセスです。本研究では、JMPを用いてHTSデータ分析のボトルネックを解消し、意思決定の迅速化を実現します。
まず最初に、これが私たちが扱う元の生データです。Excelスプレッドシート形式で提供されます。そして、これを最終的に処理したデータ、つまり最終的な成果物として、ここに2つの図を示します。1つは成長速度、つまり成長曲線を表す図です。もう1つは曲線下の面積で、これは成長実績を表す指標です。これが私たちが目指す最終成果物です。今日、私たちが達成しようとしているのはこれです。
本研究の目的は、HTS微生物増殖アッセイにおけるデータ分析時間の短縮と冗長な分析の自動化を実現するため、柔軟なデータフォーマットとクリーンアップ手法を可能にする一連のアドインを開発することであった。使用したJMP機能は、アドインビルダー、ワークフロービルダー、再コーディングツール、グラフビルダー、およびダッシュボードである。
ここで、ケリーについて少しご紹介します。ケリーは私が勤務している会社です。アイルランドの食品原料会社で、味、保存性、健康、バイオ医薬品原料の分野で世界をリードしています。ケリーでは、お客様を第一に考え、より美味しく栄養価の高い食品や飲料、健康増進サプリメント、そして命を救う医薬品を製造できるよう、原料を提供することに力を入れています。
私は医薬品事業部門に所属しており、当社の医薬品事業は100年以上の歴史があります。この事業は、賦形剤、酢酸塩、細胞栄養剤という3つの柱で構成されています。私は細胞栄養剤部門を担当しています。この部門では、バイオ医薬品やバイオテクノロジー分野で使用される細胞の栄養源として販売している、タンパク質加水分解物や酵母エキスなどの製品を取り扱っています。
ケリー社では、複合培地添加剤を提供しています。これらは、微生物学の授業を受けたことがある方ならペプトンとしても知られるタンパク質加水分解物と酵母エキスです。これらは部分的に消化可能な窒素を豊富に含む原料です。ペプチド、遊離アミノ酸、ビタミン、ミネラルなど、細胞に多くの重要な栄養素を供給するため、培地組成における主要な窒素源としてよく使用されます。
細胞栄養について話すとき、私たちはバイオサイエンス産業で使用される哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物細胞を維持するために必要な栄養分について話しているのです。これらがここで紹介する原材料です。そして、これらの細胞の種類や、それらが作り出す製品の例をいくつか挙げます。これらは、インスリン、抗体、ワクチン、プロバイオティクス、さらには抗生物質など、私たちの日常生活を改善するために使われる製品です。これらはほんの一例です。
ケリーでは、100種類以上のタンパク質加水分解物と酵母エキスを取り揃えており、これらを用いて様々な製剤を開発しています。また、自社で保有する菌株や細胞を用いてこれらの成分をスクリーニング・最適化し、お客様のニーズに基づいた製剤プロトタイプを作成することが可能です。この説明を通して、私がケリーでどのような仕事をしているのか、そして細胞栄養学とはどのようなものなのか、より深くご理解いただければ幸いです。
わかりました。ケリーでは、微生物増殖アッセイを日常的に実施しており、これは微生物用途向けの細胞栄養成分のスクリーニングに利用しています。先ほど申し上げたように、当社には使用できる成分が豊富にあります。スクリーニングを行うことで、多くの製品を迅速にテストし、製剤最適化のための最適な候補を少数に絞り込むことができます。増殖アッセイにはマイクロプレートリーダーを使用し、これはスクリーニング段階における主力機器です。
当社のプロトコルを使用すれば、1回の試験で最大40種類の成分を検査できます。また、複数の微生物株を評価できるほか、決定的なスクリーニング設計や、プラケット・バーマン法や部分因子設計などの2段階スクリーニング設計といった、実験計画法（DOE）に基づくアプローチも可能です。
例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス菌の増殖を促進する植物由来タンパク質加水分解物を探しているお客様がいるとします。ラクトバチルス・アシドフィルス菌は重要なプロバイオティクス菌株です。その場合、まず複数の植物由来タンパク質加水分解物をスクリーニングし、この微生物の最適な増殖を促進するものを1つまたは数個見つけ出します。
次に、成長アッセイのワークフローの例を示します。当社の製品は液体培地ブロスに配合されています。当社の製品のほとんどは乾燥粉末なので、水で溶かす必要があります。必要に応じて、培養する微生物に特化した他の栄養素を追加することもできます。次に、接種物があります。これは生きた活性細胞です。細胞が活発に成長し、使用前に健康であることを確認するために、これを事前に準備することがよくあります。
次に、培養液と接種液をこちらのウェルプレートにピペットで分注します。これがウェルプレートです。この場合、ウェルプレートには100個のウェルがあり、それぞれに約100～200マイクロリットルずつ分注します。この作業には、上部に示されているようなマルチチャンネルピペットを使用することがよくあります。
私たちはマイクロタイタープレートの量を扱っています。バイオスクリーニングアッセイでは、私たちが使用するバイオスクリーニングCという装置で、これらのプレートを2枚同時に実行できます。通常、各処理につき5つの技術的複製、つまり5つのウェルを実行します。一度に最大40枚まで実行できます。プレートをプレートリーダーにセットすると、プレートリーダーはバイオスクリーニング装置であり、温度と撹拌を制御できます。例として、ほとんどの細菌は37℃で24～48時間培養されます。
この装置は、時間の経過に伴う吸光度を自動的に測定します。吸光度600ナノメートル（OD600とも呼ばれます）を基準値として使用します。これは、微生物の増殖を定量化するための業界標準の指標です。細胞が複製・増殖するにつれて培養液は濁り、その濁りはOD600に比例します。細胞が増殖するにつれてOD600が増加し、その増加量を時間経過とともにプロットすることで、上部に成長曲線が表示されます。Y軸は細胞密度（OD600）、X軸は時間です。異なる栄養素は異なるレベルの増殖をもたらし、それを測定することで、成長曲線から視覚的に確認できます。
成長曲線とは何か疑問に思っているなら、成長曲線とは、細菌や酵母などの微生物の個体群が時間とともにどのように増殖するかを示す微生物動態のことです。十分な栄養分、適切な温度、適切な環境など、条件が整うと、これらの細胞は急速に分裂・増殖します。ここでは、いくつかの異なる段階を見ていきます。
まず一つ目は、誘導期です。微生物が新しい環境に初めて導入されたとき、すぐに増殖を始めるわけではありません。周囲の環境に慣れ、増殖の準備を整えるのに少し時間が必要です。これが誘導期です。そして、微生物が準備を整えると、急速に増殖を始めます。各細胞は2つ、4つ、8つと分裂を繰り返し、個体数が急速に増加します。これが成長曲線の指数関数的、あるいは対数的な段階です。
そして最終的には、食料や空間が不足したり、老廃物が蓄積したりして、成長が鈍化します。これが定常期につながります。新たに生成される細胞の数と死滅する細胞の数のバランスが取れるため、個体数は一定に保たれます。成長曲線は、成長のパフォーマンスを視覚化するのに役立ちます。このようにして比較し、ここで挙げた基準に基づいて迅速に選択することができます。
さらに、私たちが測定するもう一つの指標は、曲線下の面積です。これは、曲線の下の領域に基づいて、曲線を単一の数値に要約するために使用されます。同じ条件と時間であれば、曲線の下の領域または面積が大きいほど、全体的な成長が大きいことを意味します。これで、かなり明確になったと思います。
次に、既存のデータ処理方法についてお話しします。これまで使用してきた方法では、ExcelとJMPの両方を使用する必要がありました。Excelは、タイムポイントや曲線下の面積を手動で編集・計算したり、OD 600データをゼロにリセットしたりするために使用されていました。これについては後ほど少し説明します。その後、ジャンプを実行して、手動での再コーディングや図の編集を行いました。これは毎回最初からやり直していたため、少し面倒でした。
そして、このプロセスは毎日少しずつ異なっていました。毎回ゼロからやり直していたため、一貫性がなかったのです。そのため、データセット間で微妙なエラーや違いが見つかることがよくあり、エラーが発生しやすい状態でした。さらに、非常に時間がかかりました。1つの生データセットを処理するのに約20分かかりました。この論文でこの取り組みの中で行った改良されたアプローチは、JMPのワークフロービルダーを活用して、冗長な分析からスクリプトを抽出し、一連のアドインを構築したものです。このアプローチについては、後ほど詳しく説明します。
ワークフロービルダーの本当に素晴らしい点の1つは、私がスクリプト作成の経験がほとんどないことです。ワークフロービルダーのおかげで、既存のワークフローからスクリプトをコピー＆ペーストして、そこからアドインを作成することができました。とても簡単でした。ただし、すべてのスクリプトをワークフロービルダーから取得したわけではありません。この作業におけるより高度なスクリプト作成については、JMPシステムエンジニアである友人のジェリー・フィッシュに手伝ってもらいました。しかし、全体として、この改善されたアプローチにより、分析時間が4分に短縮され、80%の時間短縮が実現しました。これは私たちにとって非常に大きな成果です。
わかりました。すぐにここから離れて、生データファイルを表示します。そうすれば、ここで何を見ているのかがわかります。先ほど画面に表示しました。生データファイルはExcel形式です。最初の列に時間があり、その後の各列はウェルプレート上の各ウェルに対応しています。
データにはウェルプレートマップも添付しています。これは手動でファイルに追加するものですが、各ウェルに何を入れたかを把握するのに役立ちます。これは、参照しやすいマップやキーのようなものです。例えば、株Aと培地1はウェル1、21、41、61、81に入れられ、1から5は複製を表しています。ここでは最初の行を使用し、そこから株Aと培地1を取得します。以下同様です。これで、私たちがどのようにこの作業を行っているか、よりよくご理解いただけたかと思います。
さて、これでこの説明は終わりにします。次にJMPに入り、アドインについて説明していきます。アドインについてご存知ない方は、ぜひ一度ご覧ください。アドインとは、JMPソフトウェアに実行可能な追加機能を追加するためのものです。多くのユーザーが作成したアドインが存在します。私もいくつかインストールしていますが、今回はバイオスクリーニングデータに焦点を当てて説明します。それでは早速始めましょう。
まず最初に、一般的なファイルを開く操作を行います。これは先ほどお見せした Excel ファイルです。ここで「開く」をクリックし、すべてのファイルが選択されていることを確認します。そうすることで、Excel などのファイルも認識できるようになります。「開く」をクリックすると、Excel インポート ウィザードが開きます。ウェル プレート マップと生データ、つまり 600 ナノメートル データの両方をインポートします。すべては私が望むように設定されています。「インポート」をクリックします。これで 2 つの異なるデータ テーブルが作成されます。ここでは、まずデータの動態に注目します。
まず最初に、時間系列の列を追加したいと思います。この時間のフォーマットでは、時間軸に沿ってグラフを作成できないためです。これを小数点形式で表示したいのですが、このアドインはまさにそれを実現してくれました。また、この列は不要なので削除します。時間軸は時間単位の小数点形式で表示したいのです。
次に、OD補正のために行減算を行います。まず、初期データを消去します。異なる種類のメディアを使用する場合、メディアによって初期OD値が異なることがあります。ご覧のとおり、いくつかの値が異なっています。これらの値をすべて同じ条件に合わせたいので、初期OD値をゼロにします。最初の行の数値を、ここの各行から減算します。つまり、検出器をゼロにし、すべての値を同じ条件に合わせるのです。
行減算を押すと、それが実行されます。よし。次に、データをスタックします。ここで列を選択します。Shiftキーを押しながら、時間列以外のすべての列を選択します。次に、これらをスタックすると、新しいデータテーブルが作成されます。ウェル番号も再コード化しました。これはバックグラウンドで実行されました。
とりあえずこれで大丈夫です。ウェルプレートマップに戻って、JMPが認識する形式にするために少しフォーマットを調整する必要があります。ここにあるすべての複製を1つの列に積み重ねる必要があります。ここにスタックウェルプレートがあります。これにより、更新されたウェルマップデータファイルが得られます。次に、このテーブルをツール、つまりマップとして使用して、すべてのODデータ値を含むスタックデータを再コード化できます。今からそれを実行しようと思います。
ウェルプレートごとに再コード化しています。再コード化因子の一つとして菌株を使用しています。反復回数も設定しています。これらは実験においてほぼ常に一定です。もう一つは、処理ごとに異なる処理を設定していることです。1つ、2つ、3つ、4つなどです。この例では処理は1つだけですが、複数設定することも可能です。そのため、柔軟性を高めるために、このような設定にしています。
よし、これで完了し、追加処理の準備が整いました。ここで元のデータファイルに戻り、次に曲線下の面積を計算します。曲線下の面積には、独自の追加機能があります。まず最初に、行の累積和を計算します。
曲線下の面積を計算する方法は、各行を合計し、各行の累積和を計算して、最終値を取得することです。これが曲線下の面積になります。これで、ここに200列が追加されました。それらをハイライト表示し、一番下の行を選択します。これが私が求めているものだからです。ここでこのデータを使用します。14.145は、1番目の井戸の曲線下の面積です。
ここにアドインがあります。これを使うと、サブセット化したり、フォーマットを変更したりできます。ここで閉じます。ウェル番号と曲線下の面積を取得しました。このデータセットで最後に行う必要があるのは、ウェルマップでこれも再コード化することです。これは、以前行ったのと同じです。次に、株、そして複製があります。最後に行う必要があるのは、処理1です。
これでこの表は完成です。両方の表が完成しました。次のステップは、曲線下の面積表をスタックデータ表に結合することです。この2つの表を結合したいのです。実は、そのためのアドインも用意してあります。さあ、始めましょう。
この2つを組み合わせようと思った理由は、これから図を作成する際に、ダッシュボードに表示した図同士が動的にリンクするようにしたいからです。そのためには、これら2つを同じデータテーブルに格納する必要があります。
これから 2 種類の図を作成します。1 つは成長曲線で、そのためのアドインがあります。早速実行してみましょう。これは Graph Builder で作成したもので、Y 軸に OD 600、X 軸に時間があり、各菌株の成長曲線を見ることができます。これを最小化します。また、曲線下の面積も作成します。Graph Builder で作成します。Y 軸に曲線下の面積があり、X 軸にさまざまな培地成分がある、このような図になります。これは標準偏差付きの棒グラフです。エラー バーは、技術的複製全体にわたってここにあります。
最後に、ダッシュボードを実行します。ダッシュボードには、成長曲線図、曲線下の面積図が表示され、さらにデータフィルターも用意されているので、データをより詳細に操作できます。ここでは、株1を見てみましょう。このダッシュボードの設定で本当に素晴らしい点の1つは、データを操作できることです。たとえば、培地14の成長曲線を確認したい場合、自動的にここにハイライト表示されるので、非常に便利です。
さらに、ここに座って、曲線下の面積を小さい順から大きい順に並べ、上位3つの候補（ここにあるこれら）を選択することもできます。これらについては、さらに最適化作業を進めることができます。このように、生データからデータの可視化、そしてそれに基づいた意思決定に至るまで、いかに迅速に作業を進めたかがお分かりいただけるでしょう。
最後に一つだけ。少し時間が残っているので、ワークフロービルダーを使ってアドインを作成する方法の例をお見せしたいと思います。ここにあるデータセットを使ってやってみましょう。ここにある図をいくつか閉じます。この表を使います。ここで新しいワークフローを開きます。[ファイル]、[新規]、[ワークフロー]の順に選択します。ワークフロービルダーは、JMPで実際に作業しているスクリプトをキャプチャするので、それを使うにはスクリプトを記録します。そうすることで、そのスクリプトを取得して、好きなように使うことができます。この例では、それを使ってアドインを設定します。
録画ボタンを押して、これを最小化します。次に、ここに別のグラフを作成します。Y軸にOD、X軸に時間をプロットします。これらを曲線にします。処理をオーバーレイとして表示し、これを「成長曲線」と名前変更します。ここでフォントをすぐに変更します。読みやすいように大きくします。ここでフォントを変更して、太字にして、少し大きくします。時間も同様です。太字にして、少し大きくします。次に、凡例を変更します。「メディア」とします。よし、いい感じですね。
Graph Builderで作業中にWorkflow Builderがこのスクリプトをキャプチャするには、グラフを閉じる必要があることに気づきました。では、グラフを閉じます。Workflow Builderに戻ると、スクリプトがキャプチャされています。特に私のようにスクリプトの知識があまりない者にとっては、非常に便利です。
これから、この部分をハイライトしてコピーし、これを停止してから、実際に開きます...すみません、別の画面で開きます。ここでアドインをすぐに開きます。そうすれば、この例をここに配置できます。アドインビルダーを開くには、ここにある小さな下向きの三角形を選択する必要があります。
これが私が使っているアドインビルダーです。ここでメニュー項目の下に移動します。先ほど練習していたのですが、削除するのを忘れていました。今から新しい例を作成します。ダッシュボードの下の最後に追加して、コマンドをクリックするだけです。これを貼り付けます。簡単なデモンストレーションとして、いいですか？保存をクリックします。
JMPに戻ったら、この結合された動態とAUCテーブルを使います。アドインをクリックして、バイオスクリーンデータを選択します。名前は付けていないようですが、問題ありません。メニュー項目1が実行されます。これで、先ほど作成した図が生成されるはずです。生成されるかどうか見てみましょう。生成されました。完璧です。これは、ワークフロービルダーを使用してスクリプトをキャプチャする方法の一例です。このようにして、アドインに組み込むことができます。図の作成など、ルーチンで繰り返し行う作業に非常に便利です。
さて、これで終わりにします。あと数枚のスライドがあります。JMPのアドインビルダーを何に使用したのか、お分かりいただけたかと思います。バイオスクリーニングアッセイデータの処理を簡素化し、処理時間を短縮することに成功しました。80%の時間短縮です。これはどういうことでしょうか？120件のバイオスクリーニングアッセイを実施した場合、データ分析にかかる時間が1週間（40時間）から1日（8時間）に短縮されるということです。非常に大きな効果です。
私たちが実施するアッセイはどれも同じではありません。クリック操作で実行できる一連のスクリプトのおかげで、私たちが使用する様々な実験デザインから得られるデータを処理するために必要な柔軟性が得られました。ワークフロービルダーはまさに画期的なツールです。今日お見せしたものは、実はそれほど時間をかけて作成したものではありません。アドインをすべて作成するのに、合計で10時間もかからなかったと思います。以前にも申し上げたように、私はスクリプト作成の知識が限られています。そのため、私のようにコーディングの分野では初心者である人でも、非常に簡単に使いこなすことができました。
今後の取り組みとしては、これで終わりではありません。アドインや分析手法をさらに改善する機会は間違いなくあると考えています。よりルーチン的な分析の一部については、データ処理時間をさらに短縮するために、完全に自動化されたアプローチを構築できたら素晴らしいと思います。実際、私たちは既にそれを実行しています。ここでご紹介した成長アッセイ以外にも、他のルーチンデータ分析用のアドインを既に開発中です。これらを最大限に活用することで、研究室での作業やデータ処理にかかる時間を大幅に節約できます。本当に便利です。
さらに、今回の研究で使用したアドインを、同僚のジェリー・フィッシュが発表している研究、つまりJMP Proの機能データエクスプローラーを使って成長曲線から様々なパラメータを定量化する研究と組み合わせる予定です。成長速度、誘導期、定常期までの時間、定常期のOD値や細胞密度などは、データに基づいて意思決定を行う際に非常に重要なパラメータです。
ジェリーとチームを組んで、私たちがここで行ってきた研究と、彼が取り組んでいる刺激的な研究を組み合わせられることをとても楽しみにしています。詳細は後ほど。ここに彼のプレゼンテーションのリンクとタイトルを載せておきました。彼はJMPサミットでもこのプレゼンテーションを行う予定です。とても素晴らしい内容なので、機会があればぜひご覧ください。
さて、これで私の発表は終わりです。皆さんに私の連絡先をお伝えしておきます。今回の研究について何かご質問があれば、あるいは微生物学や栄養学についてお話したいという方がいらっしゃいましたら、ぜひご連絡ください。私はそういった話題について話すのが大好きなんです。今日、皆さんにこのような発表ができて本当に嬉しかったです。ご清聴ありがとうございました。近いうちに皆さんとお会いできることを願っています。それでは、ありがとうございました。
