無細胞表達（CFE）系統是一系列能夠在活細胞之外重建複雜細胞功能（如轉錄、翻譯和代謝）的方法。 CFE系統在感測、生物製造、醫學、基礎研究和教育等領域有著廣泛的生物技術應用。大多數CFE系統是由細胞裂解液與多種增強活性的賦形劑混合而成。雖然賦形劑的種類繁多使得探索組合空間充滿挑戰，但結合聲學液體處理技術進行高通量實驗，並輔以適當的統計框架，可以有效地優化配方。
本文介紹了我們如何運用實驗設計 (DOE) 來優化 CFE 特定應用場景下的輔料組合。我們將 DOE 與功能數據分析 (FDA) 結合，將活性隨時間變化的測量結果簡化為易於分析的指標。最初的配方 DOE 範例包含 5 至 14 種成分。此外，我們還描述了為擴大規模所做的努力，嘗試使用可同時測試 1536 種配方的實驗裝置，設計包含多達 42 種成分的混合物工藝 DOE。
大家好，我是來自美國陸軍發展司令部化學生物中心的馬特‧盧克斯。我將向大家介紹我們利用JMP軟體進行複雜生物系統實驗設計的一些工作。
為了提供一些背景資訊，我們研究的是一種稱為無細胞表達系統的技術。在生物技術領域，我們通常會使用細胞，細胞是非常棒的微型機器，但它們很難操控和使用。而在無細胞系統中，我們不是直接操控細胞，而是培養大量的細胞，然後將其裂解，提取細胞內部的分子結構，並將這些分子結構與編碼所需功能的DNA結合起來，從而實現我們想要的功能。
在感測應用中，您可以將這些物質塗覆在無紙基材上並進行冷凍乾燥，然後在需要進行感測反應時再進行複水。我們已將此方法應用於多種不同的領域。如右圖所示，包括飲用水、化學生物威脅和人體機能偵測。
我們已經將這項技術發展到了相當高的水平。我們已將這些反應封裝在具有塑膠外殼的紙基流體裝置中，並將其用於士兵的實戰演練，以收集有關可用性等方面的回饋。現在，我們正與一家產業合作夥伴開始生產這些裝置。
這樣做有很多優勢，但我今天最想重點談談的是快速實驗。高通量實驗通常使用機器人。利用典型的機器人技術，我們可以很好地擴大這些實驗的規模。順便提一下，我們使用 JMP 軟體為上面影片中展示的儀器的機器人參數做了實驗設計 (DOE)。但是，當你想為了研發這些反應而改變不同的組件時，這種系統就不太適用了。
為了便於理解，這些反應極為複雜。主要有三大類配方，每類都包含25種成分。裂解液成分是細胞內部的物質，含有數千種蛋白質和不同的代謝物。我們對其中許多物質的功能、相互作用等等都知之甚少。除此之外，還可以添加數十種不同的其他成分。例如，只有幾種不同的冷凍保護劑，在幾種不同的濃度下，就會產生60億種不同的組合。
人們已經研究過在不使用紙張的情況下，僅進行液體反應的實驗，例如使用帶有小孔的塑膠板裝置來添加不同的反應組分，並取得了一些進展，包括我們自己。但是，沒有人真正研究過在有紙張存在的情況下如何進行這些實驗，而紙張會以我們尚未完全理解的方式改變反應的進行。
我們搭建了一個框架，利用 JMP 軟體進行高通量實驗，並透過一些實驗將搜尋空間縮小到更易於管理的範圍。然後，我們製作了 384 張點陣紙，以便一次進行多種反應，並使用聲波液體處理技術來分配這些不同的反應物，最後使用一些定制儀器來分析顏色隨時間的變化並提取相關信息。
我們想用它做什麼？我主要要談的是，我們如何將一個原本在理論上完全行不通的低成本方案，運用這個框架重新優化，使其在理論上可行，而實際上並沒有增加任何顯著的成本。
這裡有兩種主要配方。一種叫做PANOx，它是我們以及該領域許多其他研究人員常用的配方。另一種叫做Cytomim-Cai，它的成本大約只有PANOx的百分之一，配方也更簡單一些，並且在某些應用中有效。但我們發現它在紙上完全不起作用。右側展示了這些反應在液體中的軌跡。 Cai和PANOx都能起作用。 PANOx的效果略好一些，但Cai也有效。而在插圖中，您可以看到一些紙基反應，PANOx呈現出漂亮的清澈紫色，而Cai反應則保持黃色，完全沒有信號。
這裡到底發生了什麼事？我們能解決嗎？我們的方法是採用實驗設計。在 JMP 中，我們使用二次模型和 KVC 交叉設計建構了一個混合物量設計。在第一輪實驗中，我們檢視了低成本混合物中的 16 種成分，看看增加某些成分組合的用量是否能恢復活性。
我們發現，至少有些組合確實能提供一定的活性。如果你看這張熱圖，黃色部分錶示活性增強。但這種情況只出現在少數情況。 JMP 中的模型收斂性不足以預測最佳配方。因此，我們進入第二輪，試著找出 PANOx 混合物中某些成分（一種或多種）的作用機制，看看它們是否真的有效。
我們在低成本配方的基礎上添加了一些其他成分。這樣一來，我們看到了更好的反應，並且能夠建立模型並預測一些最優配方。我們對其中一些配方進行了測試。左下角顯示的是不同的曲線。左上角的其中一個面板是PANOx，它是我們最常用的主力配方。
其他配方則是添加了不同組合PANOx的低成本配方。你可以看到它們的效果大致相同。其中一兩種效果可能好一些。這是為什麼呢？這令人興奮，但原因是什麼呢？嗯，我們也不知道。如果你看一下頂部的熱圖，它顯示了每種不同成分的添加量。深藍色代表未添加，黃色代表我們允許的最大添加量。
對於每個元件，都存在一個最優方案，要么沒有任何增益，要么增益最大。這方面沒有明確的結論。中間的表格刻意做得比較小，因為情況比較複雜。但當我們觀察雙向交互作用時，根據模型，有些交互作用顯得特別顯著。然而，即使專家分析這些交互作用，試圖從中得出一些結論，也找不到任何清晰的解釋，說明為何這些交互作用有效。而且，這些結果在不同的最優方案中也並不一致。
我們其實並不清楚原因。這表明存在更高階的交互作用，這種交互作用超越了雙向交互，這完全在意料之中，因為這些複雜系統本身就包含大量的交互作用，而且是許多複雜的交互作用。或許我們並不完全了解其中的原理，但顯然這有助於提升系統效能。
我們採用了其中一種配方，即配方4，它對成本的影響微乎其微，並將其應用到我之前提到的一些設備中。令人興奮的是，它不僅有效，而且效果甚至比我們預設的主力配方SP還要好。藍色和黃色曲線代表的是優化後的低成本配方，紫色和紅色曲線代表的是標準配方。我們可以看到效能有了顯著提升，而成本卻降低了100倍。
這次演示時間有限，但我還是想簡單提一下JMP的幾個功能，讓我們能更深入地了解它的運作原理。其中之一是它能輕鬆分析殘差，從而檢查系統誤差。我們的液體處理儀器出了名的不穩定。有時候它工作正常，非常好用。但一旦出了問題，你往往很難發現，這真是個大問題。
在第二次實驗設計中，我們發現有一個系統性的現象：前幾個反應沒有活性。殘差圖顯示了這一點，而其餘反應則呈現良好的隨機分佈。我們假設這是儀器誤差造成的，可以排除這些誤差並繼續進行實驗，從而得到我之前提到的那些理想的最優解。
我之前也沒怎麼詳細講過我們是如何取得這些軌跡，然後針對單一參數進行最佳化的。有很多方法可以做到這一點，但我們使用的是 JMP 中的函數主成分分析 (FPCA)。簡單來說，就是把所有這些不同的曲線簡化成一個單一參數，然後用這個參數可以非常精確地重建曲線。這樣我們既保留了大部分訊息，又實現了單參數優化。
我們也用類似的框架做過其他事情。我這裡舉個例子。這是能源部（DOE）的另一個項目，使用了14種用於提高貨架穩定性的成分。我們想研究的是：「這些成分還能用嗎？如果它們在悍馬車後廂放一天，會不會失效？」答案是肯定的。如果添加這些添加劑，就能在這種處理條件下恢復大部分活性。
最近我們一直在做的另一件事是擴展這個模型。我剛才提到了三個配方。這三個配方共有 42 個組分。我們嘗試對這 42 個組成進行 DOE（實驗設計），看看「或許還存在一些尚未被探索過的最佳區域」。結果導致 JMP 軟體崩潰。我們的統計學家一直在和工程師一起研究如何解決這個問題。不過，對於 36 個組分的情況，我們已經成功完成了實驗設計。
不幸的是，當我們嘗試使用該方法並出現錯誤時，我們遇到了更多之前一直在努力解決的分配問題，因為您可以看到，分配情況並不均勻隨機。有些區域根本沒有活動。這項工作仍在進行中，但能夠同時探索 JMP 軟體和儀器的極限，令人興奮。
最後，我要致謝。 David Garcia 是我們組裡的博士後，他工作非常出色，完成了本文描述的所有實驗工作。還有統計學家 Jay Davies，他用 JMP 完成了所有工作和統計分析。
