Los sistemas de expresión acelular (CFE) son un conjunto de métodos que reconstituyen funciones celulares complejas, como la transcripción, la traducción y el metabolismo, fuera de los límites de una célula viva. Los sistemas CFE tienen numerosos usos biotecnológicos en la detección, la biofabricación, la medicina, la investigación básica y la educación. La mayoría de los sistemas CFE se fabrican combinando lisados celulares con una mezcla compleja de excipientes que mejoran la actividad. Si bien la cantidad de excipientes dificulta la exploración de los espacios combinatorios, la experimentación de alto rendimiento con el manejo acústico de líquidos permite optimizar las formulaciones si se combina con un marco estadístico adecuado.
Aquí describimos nuestro uso del diseño de experimentos (DOE) para optimizar las combinaciones de excipientes en casos de uso específicos de CFE. Combinamos nuestro DOE con el análisis funcional de datos (FDA) para reducir las mediciones de actividad a lo largo del tiempo a métricas fácilmente utilizables para el análisis. Los ejemplos iniciales de DOE de formulación varían de cinco a 14 componentes. Además, describimos nuestros esfuerzos para alcanzar mayores escalas, intentando diseños de DOE de procesos mixtos con hasta 42 componentes, utilizando una configuración experimental que permite probar 1536 formulaciones simultáneamente.
Hola. Soy Matt Lux del Centro Químico-Biológico Devcom del Ejército de EE. UU. Les contaré sobre parte del trabajo que hemos estado realizando con el software JMP para el diseño de experimentos de sistemas biológicos complejos.
Para contextualizar, trabajamos en sistemas de expresión acelulares. En gran parte de la biotecnología, se utilizan células, que son máquinas diminutas, pero pueden ser muy difíciles de manipular y de trabajar con ellas. En los sistemas acelulares, en lugar de manipularlas, se cultivan un grupo de células, se abren, se extraen sus entrañas y se combina esa maquinaria molecular con el ADN que codifica la función que se desea, para luego usarla para realizar la función deseada.
Para aplicaciones de detección, se pueden colocar estos materiales sobre sustratos sin papel y liofilizarlos, para luego rehidratarlos cuando sea necesario para realizar la reacción de detección deseada. Hemos hecho esto para diversas aplicaciones. A la derecha se pueden ver: agua potable, amenazas químicas y biológicas, rendimiento humano.
Hemos llevado esta tecnología bastante lejos. Hemos empaquetado estas reacciones en dispositivos fluídicos de papel con carcasa de plástico y los hemos utilizado en eventos operativos con soldados para obtener retroalimentación sobre su usabilidad, etc. Ahora estamos empezando a fabricarlos con un socio industrial.
Hay varias ventajas en hacer esto, pero la que más quiero destacar y de la que quiero hablar hoy es la experimentación rápida. La experimentación de alto rendimiento suele utilizar robótica. Con la robótica típica, podemos escalar la producción de estos productos con bastante facilidad. Mencionaré, a modo de acotación, que usamos el software JMP para realizar un DOE de los parámetros robóticos del instrumento que se muestra en el video de arriba. Sin embargo, cuando se intenta modificar los diferentes componentes para la investigación y el desarrollo de estas reacciones, este tipo de sistema no es tan eficaz.
Para contextualizar, estas reacciones son extremadamente complejas. Existen tres familias principales de recetas, cada una con 25 componentes. El lisado es el tejido celular, que contiene miles de proteínas y diferentes metabolitos. Desconocemos la función de muchos de ellos, cómo interactúan, etc. Además, se pueden añadir docenas de componentes adicionales. Por ejemplo, al analizar diferentes crioprotectores, con solo unas pocas concentraciones, se obtienen seis mil millones de combinaciones diferentes.
Realizar estos experimentos solo en reacciones líquidas sin papel, en configuraciones de placas de plástico con pequeños pocillos que permiten añadir diferentes componentes, ha sido un trabajo en curso, incluso nosotros, y se han logrado avances. Pero nadie había trabajado realmente en cómo hacerlo en presencia de papel, ya que este puede alterar el rendimiento de las reacciones de maneras que no comprendemos del todo.
Configuramos un marco para realizar experimentos de alto rendimiento con el software JMP y algunos experimentos para reducir el espacio de búsqueda a un nivel más manejable. Luego, creamos estos 384 tickets de papel para permitirnos realizar varias reacciones a la vez, utilizamos manipulación acústica de líquidos para dosificar estas diferentes reacciones y, posteriormente, instrumentación personalizada que analiza el cambio de color a lo largo del tiempo y extrae esa información.
¿Para qué queremos usar esto? El tema principal que abordaré es cómo tomamos una receta de bajo costo que no funcionaba en absoluto en teoría y luego usamos este marco para reoptimizarla y que funcione en teoría sin añadir costos significativos.
Aquí hay dos recetas principales. Una se llama PANOx, que es una especie de fórmula de referencia para nosotros y muchos otros en el campo. La segunda, llamada Cytomim-Cai, es aproximadamente cien veces más económica, un poco más sencilla y funciona en ciertas aplicaciones. Sin embargo, descubrimos que no funcionaba en absoluto en teoría. A la derecha, se pueden ver las trayectorias de estas reacciones en líquidos. Tanto Cai como PANOx funcionan. PANOx funciona un poco mejor, pero Cai sigue funcionando, mientras que en el recuadro se ven algunas reacciones en teoría donde PANOx adquiere un bonito color púrpura claro, pero las reacciones de Cai permanecen amarillas; no se obtiene ninguna señal.
¿Qué sucede? ¿Podemos solucionarlo? Nuestro enfoque fue usar el diseño de experimentos. En JMP, construimos un diseño de cantidad de mezcla usando un modelo cuadrático y el cruce KVC. Para la primera ronda, analizamos 16 componentes de la mezcla de bajo costo para ver si añadir más de alguna combinación de ellos recuperaría la actividad.
Descubrimos que algunas combinaciones sí proporcionan, al menos, actividad superior a cero. Si observan este mapa de calor, el color amarillo indica mayor actividad. Pero solo en algunos casos. No fue suficiente converger el modelo en JMP para predecir formulaciones óptimas. Luego pasamos a una segunda ronda donde, bueno, quizás sea algo en la combinación de PANOx, uno o más factores, lo que le permite funcionar bien en teoría.
Añadimos algunos de esos componentes a la combinación de bajo costo. Aquí, observamos una respuesta mucho mejor y logramos converger un modelo y predecir algunas formulaciones óptimas. Probamos algunos de ellos. En la parte inferior izquierda, se ven diferentes trayectorias. Arriba a la izquierda, uno de esos paneles es el PANOx, el más potente, el que más usamos.
Las otras son fórmulas de bajo costo con diferentes combinaciones de PANOx. Se puede ver que funcionan aproximadamente igual de bien. Quizás una o dos funcionen un poco mejor. ¿A qué se debe esto? Es emocionante, pero ¿por qué? Bueno, no lo sabemos. Si observan el mapa de calor de la parte superior, se muestra la cantidad añadida de cada componente. El azul marino no representa nada, y el amarillo es el máximo permitido.
Para cada componente, existe una formulación óptima que no aporta nada o aporta el máximo. No hay indicaciones claras al respecto. La tabla central es intencionadamente pequeña por su complejidad. Sin embargo, al observar las interacciones bidireccionales, algunas destacan como significativas según el modelo. Sin embargo, al consultar a un experto para obtener información, no hay nada claro que explique por qué funcionan. Tampoco son consistentes en las diferentes formulaciones óptimas.
No sabemos realmente por qué. Esto indica interacciones de orden superior entre interacciones más allá de las bidireccionales, lo cual es totalmente previsible, ya que estos sistemas complejos tienen muchas interacciones. Muchas interacciones complejas. Quizás no sepamos por qué, pero claramente mejora el rendimiento.
Tomamos una de las formulaciones, la número 4, que prácticamente aumentó el costo de forma insignificante, y la incorporamos a algunos de los dispositivos que mencioné antes. Sorprendentemente, no solo funcionó, sino que funcionó incluso mejor que nuestro producto estrella, el SP. Las curvas azul y amarilla representan la combinación optimizada de bajo costo, y las curvas púrpura y roja, la combinación estándar. Observamos una mejora bastante sustancial, pero con un costo cien veces menor.
No tengo mucho tiempo en esta presentación, pero quería al menos mencionar un par de cosas que JMP nos ha permitido lograr, como analizar un poco más a fondo. Una de ellas es la capacidad de analizar fácilmente los residuos para detectar errores sistemáticos. Nuestro instrumento de manejo de líquidos es conocido por su pulcritud. A veces, cuando funciona, es excelente. Cuando no, no siempre se sabe que no funciona, lo cual es un gran problema.
Aquí, en el segundo DOE que realizamos, observamos que había un conjunto sistemático donde, en las primeras reacciones, no hubo actividad. Los gráficos de residuos lo muestran, mientras que el resto presenta una distribución aleatoria y uniforme. Suponemos que se trata de un error de instrumentación, por lo que podemos excluirlos y continuar, obteniendo así los óptimos que mencioné.
Tampoco hablé mucho sobre cómo tomamos estas trayectorias, sino sobre cómo optimizamos con un solo parámetro. Hay muchas maneras de hacerlo, pero la que hicimos fue mediante el Análisis de Componentes Principales Funcionales en JMP. En resumen, podemos tomar todas estas curvas diferentes y reducirlas a un solo parámetro que permite reconstruir la curva con bastante fidelidad. Podemos conservar la mayor parte de la información, pero aun así realizar una optimización con un solo parámetro.
También hemos utilizado este mismo tipo de marco para otras cosas. Les daré un ejemplo. Este es otro DOE que utiliza 14 componentes para la estabilidad en almacenamiento. Queríamos preguntarnos: "¿Se pueden usar estos componentes? Si se dejan en la parte trasera de un Humvee durante un día, ¿se deteriorarán?". La respuesta es sí. Si se añaden estos aditivos, se puede recuperar la mayor parte de esa actividad con este tipo de tratamiento.
Otra cosa en la que hemos estado trabajando recientemente es en expandir esto. Mencioné las tres recetas. Hay 42 componentes que, en cierto modo, se constituyeron como la unión de esas recetas. Intentamos hacer un análisis de desdoblamiento de los 42 componentes para buscar: "Oye, tal vez haya otra región óptima que nadie haya explorado". Esto provocó un bloqueo del software JMP. Nuestros estadísticos han estado trabajando con los ingenieros para ver si podían resolverlo. Pero con 36 componentes, pudimos hacerlo.
Desafortunadamente, al usar esto con errores, nos encontramos con más problemas de dispensación que hemos estado solucionando, ya que, como pueden ver, la distribución no es correcta y aleatoria. Hay regiones donde simplemente no hay actividad. Este es un trabajo en progreso, pero es emocionante trabajar tanto con los límites del software JMP como con la instrumentación.
Dicho esto, solo quiero agradecer a David García, investigador postdoctoral de nuestro grupo, quien realizó un trabajo fantástico y realizó todo el trabajo experimental descrito aquí. Jay Davies, estadístico, realizó todo el trabajo con JMP y el análisis estadístico.
