无细胞表达（CFE）系统是一系列能够在活细胞之外重建复杂细胞功能（如转录、翻译和代谢）的方法。CFE系统在传感、生物制造、医学、基础研究和教育等领域有着广泛的生物技术应用。大多数CFE系统由细胞裂解液与多种增强活性的赋形剂混合而成。虽然赋形剂的种类繁多使得探索组合空间充满挑战，但结合声学液体处理技术进行高通量实验，并辅以适当的统计框架，可以有效地优化配方。
本文介绍了我们如何运用实验设计 (DOE) 来优化 CFE 特定应用场景下的辅料组合。我们将 DOE 与功能数据分析 (FDA) 相结合，将活性随时间变化的测量结果简化为易于分析的指标。最初的配方 DOE 示例包含 5 至 14 种成分。此外，我们还描述了为扩大规模所做的努力，尝试使用可同时测试 1536 种配方的实验装置，设计包含多达 42 种成分的混合物工艺 DOE。
大家好，我是来自美国陆军发展司令部化学生物中心的马特·卢克斯。我将向大家介绍我们利用JMP软件进行复杂生物系统实验设计的一些工作。
为了提供一些背景信息，我们研究的是一种叫做无细胞表达系统的技术。在生物技术领域，我们通常会用到细胞，细胞是非常棒的微型机器，但它们很难操控和使用。而在无细胞系统中，我们不是直接操控细胞，而是培养大量的细胞，然后将其裂解，提取细胞内部的分子机制，并将这些分子机制与编码所需功能的DNA结合起来，从而实现我们想要的功能。
在传感应用中，您可以将这些物质涂覆在无纸基材上并进行冷冻干燥，然后在需要进行传感反应时再进行复水。我们已将此方法应用于多种不同的领域。如右图所示，包括饮用水、化学生物威胁和人体机能检测。
我们已经将这项技术发展到了相当高的水平。我们已将这些反应封装在带有塑料外壳的纸基流体装置中，并将其用于士兵的实战演练，以收集有关可用性等方面的反馈。现在，我们正与一家行业合作伙伴开始生产这些装置。
这样做有很多优势，但我今天最想重点谈谈的是快速实验。高通量实验通常使用机器人。利用典型的机器人技术，我们可以很好地扩大这些实验的规模。顺便提一下，我们使用 JMP 软件为上面视频中展示的仪器的机器人参数做了实验设计 (DOE)。但是，当你想为了研发这些反应而改变不同的组件时，这种系统就不太适用了。
为了便于理解，这些反应极其复杂。主要有三大类配方，每类都包含25种成分。裂解液成分是细胞内部的物质，含有数千种蛋白质和不同的代谢物。我们对其中许多物质的功能、相互作用等知之甚少。除此之外，还可以添加数十种不同的其他成分。例如，仅几种不同的冷冻保护剂，在几种不同的浓度下，就会产生60亿种不同的组合。
人们已经研究过在不使用纸张的情况下，仅进行液体反应的实验，例如使用带有小孔的塑料板装置来添加不同的反应组分，并取得了一些进展，包括我们自己。但是，没有人真正研究过在有纸张的情况下如何进行这些实验，而纸张会以我们尚未完全理解的方式改变反应的进行。
我们搭建了一个框架，利用 JMP 软件进行高通量实验，并通过一些实验将搜索空间缩小到更易于管理的范围。然后，我们制作了 384 张点阵纸，以便一次性进行多种反应，并使用声波液体处理技术来分配这些不同的反应物，最后使用一些定制仪器来分析颜色随时间的变化并提取相关信息。
我们想用它做什么？我主要要谈的是，我们如何将一个原本在理论上完全行不通的低成本方案，利用这个框架重新优化，使其在理论上可行，而实际上并没有增加任何显著的成本。
这里有两种主要配方。一种叫做PANOx，它是我们以及该领域许多其他研究人员常用的配方。另一种叫做Cytomim-Cai，它的成本大约只有PANOx的百分之一，配方也更简单一些，并且在某些应用中有效。但我们发现它在纸上完全不起作用。右侧展示了这些反应在液体中的轨迹。Cai和PANOx都能起作用。PANOx的效果略好一些，但Cai也有效。而在插图中，您可以看到一些纸基反应，PANOx呈现出漂亮的清澈紫色，而Cai反应则保持黄色，完全没有信号。
这里到底发生了什么？我们能解决吗？我们的方法是采用实验设计。在 JMP 中，我们使用二次模型和 KVC 交叉设计构建了一个混合物量设计。在第一轮实验中，我们考察了低成本混合物中的 16 种成分，看看增加某些成分组合的用量是否能恢复活性。
我们发现，至少有些组合确实能提供一定的活性。如果你看一下这张热图，黄色区域表示活性增强。但这种情况只出现在少数情况下。在JMP中，模型收敛不足以预测最佳配方。因此，我们进入第二轮，尝试找出PANOx混合物中某些成分（一个或多个）的作用机制，看看它是否真的有效。
我们在低成本配方的基础上添加了一些其他成分。这样一来，我们看到了更好的响应，并且能够建立模型并预测一些最优配方。我们对其中一些配方进行了测试。左下角显示的是不同的曲线。左上角的其中一个面板是PANOx，它是我们最常用的主力配方。
其他配方则是添加了不同组合PANOx的低成本配方。你可以看到它们的效果大致相同。其中一两种效果可能更好一些。这是为什么呢？这令人兴奋，但原因是什么呢？嗯，我们也不知道。如果你看一下顶部的热图，它显示了每种不同成分的添加量。深蓝色代表未添加，黄色代表我们允许的最大添加量。
对于每个组件，都存在一个最优方案，要么没有任何增益，要么增益最大。这方面没有明确的结论。中间的表格特意做得比较小，因为情况比较复杂。但当我们观察双向交互作用时，根据模型，有些交互作用显得尤为显著。然而，即使专家分析这些交互作用，试图从中得出一些结论，也找不到任何清晰的解释，说明这些交互作用为何有效。而且，这些交互作用在不同最优方案之间也并不一致。
我们其实并不清楚原因。这表明存在更高阶的交互作用，这种交互作用超越了双向交互，这完全在意料之中，因为这些复杂系统本身就包含大量的交互作用，而且是许多复杂的交互作用。或许我们并不完全了解其中的原理，但显然这有助于提升系统性能。
我们采用了其中一种配方，即配方4，它对成本的影响微乎其微，并将其应用到我之前提到的一些设备中。令人兴奋的是，它不仅有效，而且效果甚至比我们默认的主力配方SP还要好。蓝色和黄色曲线代表的是优化后的低成本配方，紫色和红色曲线代表的是标准配方。我们可以看到性能有了显著提升，而成本却降低了100倍。
这次演示时间有限，但我还是想简单提一下JMP的几个功能，让我们能更深入地了解它的工作原理。其中之一是它能轻松分析残差，从而检查系统误差。我们的液体处理仪器出了名的不稳定。有时候它工作正常，非常好用。但一旦出了问题，你往往很难发现，这可真是个大问题。
在第二次实验设计中，我们发现存在一个系统性的问题，即前几个反应没有活性。残差图显示了这一点，而其余反应则呈现良好的随机分布。我们假设这是仪器误差造成的，可以排除这些误差并继续进行实验，从而得到我之前提到的那些理想的最优解。
我之前也没怎么详细讲过我们是如何获取这些轨迹，然后针对单个参数进行优化的。有很多方法可以做到这一点，但我们使用的是 JMP 中的函数主成分分析 (FPCA)。简单来说，就是把所有这些不同的曲线简化成一个单一参数，然后用这个参数可以非常精确地重构出原来的曲线。这样我们既保留了大部分信息，又实现了单参数优化。
我们也用类似的框架做过其他事情。我这里举个例子。这是能源部（DOE）的另一个项目，使用了14种用于提高货架稳定性的成分。我们想研究的是：“这些成分还能用吗？如果它们在悍马车后厢放一天，会不会失效？”答案是肯定的。如果添加这些添加剂，就能在这种处理条件下恢复大部分活性。
最近我们一直在做的另一件事是扩展这个模型。我刚才提到了三个配方。这三个配方共有 42 个组分。我们尝试对这 42 个组分进行 DOE（实验设计），看看“或许还存在一些尚未被探索过的最佳区域”。结果导致 JMP 软件崩溃。我们的统计学家一直在和工程师一起研究如何解决这个问题。不过，对于 36 个组分的情况，我们已经成功完成了实验设计。
不幸的是，当我们尝试使用该方法并出现错误时，我们遇到了更多之前一直在努力解决的配药问题，因为您可以看到，配药分布并不均匀随机。有些区域完全没有配药活动。这项工作仍在进行中，但能够同时探索 JMP 软件和仪器的极限，令人兴奋。
最后，我要致谢。David Garcia 是我们组里的博士后，他工作非常出色，完成了本文描述的所有实验工作。还有统计学家 Jay Davies，他用 JMP 完成了所有工作和统计分析。
