무세포 발현(CFE) 시스템은 살아있는 세포 외부에서 전사, 번역, 대사 등 복잡한 세포 기능을 재현하는 일련의 방법입니다. CFE 시스템은 센싱, 바이오 제조, 의학, 기초 연구 및 교육 등 다양한 생명공학 분야에서 활용됩니다. 대부분의 CFE 시스템은 세포 용해물에 활성을 향상시키는 다양한 부형제를 복합적으로 혼합하여 만들어집니다. 부형제의 종류가 많아 최적의 조합 공간을 탐색하는 것이 어렵지만, 음향 액체 처리 기술을 이용한 고처리량 실험과 적절한 통계적 분석법을 결합하면 최적의 제형을 도출하는 것이 가능합니다.
본 연구에서는 CFE의 특정 사용 사례에 최적화된 부형제 조합을 얻기 위해 실험 설계(DOE)를 활용하는 방법을 설명합니다. 또한, DOE와 기능 데이터 분석(FDA)을 결합하여 시간에 따른 활성 측정값을 분석에 쉽게 사용할 수 있는 지표로 변환했습니다. 초기 제형 DOE 예시는 5~14개의 성분으로 구성되었습니다. 더 나아가, 1,536개의 제형을 동시에 테스트할 수 있는 실험 장치를 사용하여 최대 42개의 성분을 포함하는 혼합 공정 DOE 설계를 시도하는 등 규모 확장을 위한 노력을 설명합니다.
안녕하세요. 저는 미 육군 개발통신화학생물센터의 맷 럭입니다. 복잡한 생물 시스템의 실험 설계를 위해 JMP 소프트웨어를 활용하는 저희 연구 활동에 대해 말씀드리겠습니다.
배경 설명을 드리자면, 저희는 무세포 발현 시스템이라는 것을 연구하고 있습니다. 생명공학의 많은 분야에서는 세포를 사용하는데, 세포는 놀랍고 훌륭한 기계이지만 조작하고 다루기가 매우 어렵습니다. 무세포 시스템에서는 세포를 조작하는 대신, 세포를 배양하고, 세포를 파괴하여 내부 물질을 추출합니다. 그리고 추출한 분자 구조와 원하는 기능을 수행하는 DNA를 결합하여 원하는 기능을 구현하는 데 사용할 수 있습니다.
감지 응용 분야의 경우, 이러한 물질을 종이 없는 기판에 부착하여 동결 건조한 다음, 필요할 때 다시 수분을 공급하여 원하는 감지 반응을 수행할 수 있습니다. 저희는 이미 다양한 응용 분야에 이 기술을 적용했습니다. 오른쪽에서 보시는 것처럼 식수, 화학·생물학적 위협, 인체 성능 측정 등에 활용하고 있습니다.
저희는 이 기술을 상당히 발전시켰습니다. 이러한 반응을 플라스틱 하우징이 있는 종이 유체 장치에 담아 병사들을 대상으로 실제 운용 환경에서 사용해보고 사용성 등에 대한 피드백을 수집했습니다. 이제 산업 파트너와 함께 이러한 장치를 생산하기 시작했습니다.
이렇게 하는 데에는 여러 가지 장점이 있지만, 오늘 제가 가장 강조하고 싶은 것은 신속한 실험입니다. 대량 실험에는 보통 로봇 공학이 사용됩니다. 일반적인 로봇 공학을 이용하면 이러한 실험 장비의 생산량을 상당히 늘릴 수 있습니다. 참고로, 위 영상에 나온 장비의 로봇 공학 매개변수에 대한 실험 설계(DOE)를 위해 JMP 소프트웨어를 사용했습니다. 하지만 이러한 반응의 연구 개발을 위해 다양한 구성 요소를 변경해야 할 때는 이러한 시스템이 그다지 적합하지 않습니다.
좀 더 자세히 설명하자면, 이러한 반응들은 매우 복잡합니다. 크게 세 가지 주요 반응 공식이 있는데, 각각 25가지 구성 요소로 이루어져 있습니다. 세포 용해물은 세포 내부 물질로, 수천 가지의 단백질과 다양한 대사 산물이 존재합니다. 우리는 이러한 물질들이 어떤 기능을 하는지, 어떻게 상호작용하는지 등을 아직 제대로 알지 못합니다. 게다가, 수십 가지의 다른 구성 요소를 추가할 수도 있습니다. 예를 들어, 다양한 냉동 보호제를 살펴보면, 몇 가지 농도만 바꿔도 60억 가지의 조합이 가능합니다.
종이 없이 액체 반응만을 이용한 실험, 즉 다양한 성분을 첨가할 수 있는 작은 구멍이 있는 플라스틱 플레이트 장치를 사용한 실험은 이미 여러 연구자들이 진행해 왔고, 저희도 그중 하나입니다. 하지만 종이가 존재하는 환경에서 이러한 실험을 어떻게 진행해야 하는지에 대해서는 제대로 연구한 사람이 없었습니다. 종이는 우리가 아직 완전히 이해하지 못하는 방식으로 반응의 양상을 바꿀 수 있기 때문입니다.
저희는 JMP 소프트웨어를 사용하여 고처리량 실험을 수행할 수 있는 프레임워크를 구축하고, 탐색 공간을 보다 관리하기 쉬운 수준으로 줄이기 위한 몇 가지 실험을 진행했습니다. 그런 다음, 여러 반응을 동시에 진행할 수 있도록 384개의 스팟이 있는 종이 티켓을 제작하고, 음향 액체 처리 장치를 사용하여 다양한 반응물을 분배하고, 시간에 따른 색 변화를 분석하고 그 정보를 추출하는 맞춤형 계측 장비를 사용했습니다.
우리는 이것을 무엇에 사용하려고 할까요? 제가 주로 이야기할 것은, 이론상으로는 전혀 효과가 없었던 저비용 레시피를 이 프레임워크를 사용하여 실제 비용을 크게 추가하지 않고도 이론상으로는 효과가 있는 것처럼 재최적화하는 방법입니다.
여기에는 두 가지 주요 레시피가 있습니다. 하나는 PANOx라고 합니다. 이 레시피는 저희를 비롯한 이 분야의 많은 사람들이 주로 사용하는 핵심 레시피입니다. 다른 하나는 Cytomim-Cai라고 하는데, 가격이 약 100배 저렴하고 구조가 조금 더 간단하며 특정 응용 분야에서 효과가 있습니다. 하지만 저희는 이 레시피가 종이 상에서는 전혀 효과가 없다는 것을 발견했습니다. 오른쪽 그림에서 액체 반응에서 나타나는 두 레시피의 변화 양상을 볼 수 있습니다. Cai와 PANOx 모두 효과가 있습니다. PANOx가 조금 더 효과적이지만 Cai도 여전히 효과가 있습니다. 반면 삽입된 그림에서는 종이 상 반응에서 PANOx는 선명한 보라색을 띠는 반면 Cai 반응은 노란색을 유지하며 아무런 신호도 나타나지 않는 것을 볼 수 있습니다.
무슨 문제가 있는 걸까요? 해결할 수 있을까요? 저희는 실험 설계법을 사용했습니다. JMP에서 2차 모델과 KVC 교차를 이용하여 혼합량 설계를 구축했습니다. 첫 번째 단계에서는 저비용 혼합물에서 16가지 성분을 살펴보고, 특정 조합으로 더 첨가했을 때 활성이 회복되는지 확인했습니다.
일부 조합에서는 적어도 0보다는 높은 활성도가 나타나는 것을 확인했습니다. 이 히트맵을 보시면 노란색은 활성도 증가를 나타냅니다. 하지만 이는 몇몇 경우에만 해당됩니다. JMP에서 모델을 수렴시켜 최적의 제형을 예측할 수 있을 만큼 충분하지 않았습니다. 그래서 두 번째 단계로 넘어갔는데, 아마도 PANOx 혼합물의 어떤 성분, 즉 이론상으로는 잘 작동하는 것처럼 보이는 한 가지 이상의 요소가 있는 것 같습니다.
우리는 저비용 혼합물에 몇 가지 구성 요소를 추가했습니다. 그 결과 훨씬 더 나은 반응을 보였고, 모델을 수렴시켜 최적의 배합을 예측할 수 있었습니다. 이러한 배합 중 일부를 테스트해 보았습니다. 왼쪽 하단에는 다양한 궤적이 표시되어 있습니다. 왼쪽 상단에 있는 패널 중 하나는 우리가 가장 많이 사용하는 핵심 모델인 PANOx입니다.
나머지 제품들은 PANOx를 다양한 조합으로 첨가한 저가형 제형들입니다. 보시다시피 효과는 대체로 비슷합니다. 한두 가지는 오히려 조금 더 나은 효과를 보이기도 합니다. 왜 그럴까요? 흥미로운 사실이지만, 그 이유는 아직 밝혀지지 않았습니다. 위쪽의 히트맵을 보시면 각 성분이 얼마나 첨가되었는지 알 수 있습니다. 짙은 남색은 아무것도 첨가되지 않은 상태이고, 노란색은 허용된 최대 함량입니다.
각 구성 요소에 대해 아무런 효과를 더하지 않거나 최대 효과를 내는 최적의 조합이 존재합니다. 하지만 명확한 단서는 없습니다. 가운데 표는 내용이 복잡해서 의도적으로 작게 만들었습니다. 하지만 양방향 상호작용을 살펴보면 모델에 따라 유의미한 것으로 나타나는 몇 가지 요소가 있습니다. 그러나 전문가가 이러한 요소들을 살펴보고 통찰력을 도출하려고 해도, 왜 이런 현상이 나타나는지 명확하게 설명할 만한 단서는 없습니다. 또한 최적의 조합들 간에도 일관성이 없습니다.
정확한 이유는 알 수 없습니다. 이는 2차 상호작용 이상의 고차 상호작용을 시사하는데, 이러한 복잡한 시스템에는 수많은 상호작용이 존재하기 때문에 당연한 결과입니다. 복잡한 상호작용이 매우 많죠. 정확한 이유는 알 수 없지만, 분명 성능 향상에 도움이 됩니다.
저희는 비용 증가가 미미한 4번 배합을 선택하여 앞서 말씀드린 기기들에 적용해 보았습니다. 놀랍게도, 효과가 있었을 뿐만 아니라 기존에 사용하던 SP보다 훨씬 뛰어난 성능을 보였습니다. 파란색과 노란색 곡선은 최적화된 저비용 배합을 나타내고, 보라색과 빨간색 곡선은 표준 배합을 나타냅니다. 비용은 100배나 낮으면서도 성능은 상당히 향상된 것을 확인할 수 있습니다.
이번 발표 시간이 많지는 않지만, JMP 덕분에 여기까지 올 수 있었던 몇 가지 중요한 점들을 간략하게 소개하고 싶었습니다. 예를 들어, 시스템 오류를 확인하기 위해 잔류값을 쉽게 분석할 수 있다는 점입니다. 저희 액체 처리 장비는 악명이 높을 정도로 문제가 많습니다. 제대로 작동할 때는 아주 훌륭하지만, 고장이 났을 때는 고장 여부를 알 수 없는 경우가 많아 큰 문제가 됩니다.
두 번째 실험 설계에서 우리는 처음 몇 가지 반응에서 활성이 전혀 나타나지 않는 체계적인 패턴을 발견했습니다. 잔차 플롯에서 이를 확인할 수 있으며, 나머지 반응들은 고르게 무작위로 분포되어 있습니다. 이는 기기 오차로 추정되며, 해당 반응들을 제외하고 진행하면 앞서 말씀드린 최적값을 얻을 수 있습니다.
제가 이 궤적들을 어떻게 도출하고 단일 매개변수를 최적화했는지에 대해서는 자세히 말씀드리지 않았지만, 여러 가지 방법이 있지만 저희는 JMP의 함수 주성분 분석(Functional Principal Component Analysis)을 사용했습니다. 간단히 말해서, 여러 곡선을 하나의 매개변수로 축소하여 상당히 높은 정확도로 원래 곡선을 재구성할 수 있습니다. 대부분의 정보를 유지하면서도 단일 매개변수 최적화를 수행할 수 있는 것입니다.
저희는 이와 같은 틀을 다른 여러 가지에도 적용해 왔습니다. 한 가지 예를 들어보겠습니다. 이것은 보관 안정성을 위해 사용되는 14가지 성분을 활용한 또 다른 실험 설계(DOE)입니다. 저희는 "이 성분들을 사용할 수 있을까? 험비 차량 뒤에 하루 동안 방치하면 활성이 사라질까?"라는 질문에 대한 답을 찾고자 했습니다. 답은 "그렇다"입니다. 첨가제를 넣으면 그러한 환경에서도 활성을 대부분 회복할 수 있습니다.
그리고 최근에 저희가 집중적으로 작업해 온 또 다른 부분은 이 부분을 확장하는 것입니다. 앞서 말씀드린 세 가지 레시피 외에도, 이 레시피들을 합친 것과 같은 42개의 구성 요소가 있습니다. 저희는 이 42개 구성 요소 모두에 대해 실험 설계를 시도하여 "아직 아무도 탐색하지 않은 최적 영역이 있을지도 몰라"라고 생각했습니다. 하지만 JMP 소프트웨어가 다운되는 문제가 발생했습니다. 저희 통계 전문가들이 엔지니어들과 협력하여 이 문제를 해결하려고 노력하고 있습니다. 하지만 36개 구성 요소에 대해서는 실험 설계를 성공적으로 수행할 수 있었습니다.
안타깝게도 오류가 있는 상태에서 이를 사용하려고 하면, 이전에 해결하려고 노력했던 분배 문제들이 더 많이 발생합니다. 보시다시피, 약물이 고르게 무작위로 분포되지 않고, 활동이 전혀 없는 영역들이 있습니다. 이는 진행 중인 작업이지만, JMP 소프트웨어와 계측 장비 모두의 한계를 시험해 볼 수 있다는 점은 매우 흥미롭습니다.
그럼 감사의 말씀을 드리겠습니다. 데이비드 가르시아는 우리 연구실의 박사후 연구원으로, 이 논문에 기술된 모든 실험을 훌륭하게 수행해 주었습니다. 그리고 통계학자인 제이 데이비스는 JMP를 이용한 모든 작업과 통계 분석을 담당해 주었습니다.
