無細胞発現（CFE）システムは、転写、翻訳、代謝といった複雑な細胞機能を生細胞の外で再構成する一連の手法です。CFEシステムは、センシング、バイオ製造、医療、基礎研究、教育など、様々なバイオテクノロジー分野で利用されています。ほとんどのCFEシステムは、細胞溶解物と活性を向上させる複雑な賦形剤の混合物を組み合わせて作られています。賦形剤の数が多いため、組み合わせ空間の探索は困難ですが、音響液体ハンドリングを用いたハイスループット実験と適切な統計的フレームワークを組み合わせることで、製剤の最適化が可能になります。
本稿では、CFEの特定のユースケースにおける添加剤の組み合わせを最適化するための実験計画法（DOE）の活用法について解説します。DOEと機能データ分析（FDA）を組み合わせることで、経時的な活性測定を、分析に容易に使用できる指標に集約します。初期の製剤DOEの例は、5成分から14成分まで多岐にわたります。さらに、より大規模なスケールへの取り組みとして、1,536種類の製剤を同時に試験できる実験セットアップを用いて、最大42成分の混合プロセスDOE設計を試みる方法についても説明します。
こんにちは。アメリカ陸軍開発司令部化学生物学センターのマット・ラックスです。複雑な生物システムの実験計画にJMPソフトウェアを活用した取り組みについてお話ししたいと思います。
背景を説明すると、私たちは「無細胞発現システム」と呼ばれるものに取り組んでいます。バイオテクノロジーの多くの分野では細胞が用いられますが、細胞は素晴らしく驚くべき小さな機械ですが、操作や研究が非常に難しい場合があります。無細胞システムでは、細胞を操作するのではなく、細胞を大量に培養し、それらを破壊して中身を採取し、その分子機構と、目的の機能をコード化したDNAを組み合わせます。そして、それを用いて目的の機能を発揮させます。
センシング用途では、これらの材料をペーパーレス基板上に置き、凍結乾燥させます。そして、必要な時に水分を補給することで、センシング反応を行うことができます。私たちは様々な用途でこの技術を用いてきました。右側には、飲料水、化学生物兵器の脅威、人間のパフォーマンスなどが示されています。
この技術はかなり進化しました。これらの反応をプラスチック製の筐体に収めた紙製の流体デバイスに組み込み、兵士たちによる実戦演習で使用して、使い勝手などに関するフィードバックを得ました。現在、業界パートナーと共同で製造を開始しています。
これには多くの利点がありますが、今日最も強調してお話ししたいのは、迅速な実験です。ハイスループット実験では通常、ロボット工学が用いられます。一般的なロボット工学を用いることで、これらの実験のスケールアップをかなりスムーズに行うことができます。ちなみに、上のビデオで紹介した装置のロボット工学パラメータのDOE（実験計画法）はJMPソフトウェアを使用して行いました。しかし、これらの反応の研究開発において様々なコンポーネントを変更しようとする場合、この種のシステムはあまり適していません。
これらの反応は非常に複雑です。主に3つのレシピファミリーがあり、それぞれ25種類の成分が使われています。ライセート成分は細胞の中心部分で、数千種類のタンパク質と様々な代謝物が含まれています。それらの多くが何をするのか、どのように相互作用するのかなど、まだ分かっていません。それに加えて、数十種類もの異なる成分を添加することも可能です。例えば、様々な凍結保護剤を例に挙げると、濃度が数種類異なるだけで、60億通りの組み合わせが考えられます。
紙を使わず、様々な成分を添加できる小さなウェルを備えたプラスチックプレートを用いて液体反応だけで実験を行うという手法は、私たちを含め、既に多くの研究者が研究し、ある程度の進歩を遂げてきました。しかし、紙の存在下でどのように実験を行うかについては、誰も真剣に研究していませんでした。紙の存在は、反応の挙動を私たちには完全には理解されていない形で変化させる可能性があるからです。
JMPソフトウェアを用いてハイスループット実験を行うためのフレームワークを構築し、探索空間をより扱いやすい範囲に縮小するための実験もいくつか行いました。次に、384枚のスポット紙チケットを作成し、複数の反応を一度に行えるようにします。アコースティックリキッドハンドリングを用いてこれらの反応を分注し、さらに、経時的な色の変化を分析して情報を抽出するためのカスタム機器を導入します。
これを何に使うのでしょうか？主にお話ししたいのは、紙上では全く機能しなかった低コストのレシピを、このフレームワークを使って再最適化し、実際には大きなコストを追加することなく、紙上で機能するようにしたという点です。
ここには2つの主要なレシピがあります。1つはPANOxと呼ばれるもので、これは私たちやこの分野の多くの人々にとって、いわば主力レシピです。もう1つはCytomim-Caiと呼ばれるもので、これは約100分の1のコストで、少しシンプルで、特定の用途では機能します。しかし、紙上では全く機能しないことがわかりました。右側は、液体反応におけるこれらの軌跡を示しています。CaiとPANOxはどちらも機能します。PANOxの方が少し優れていますが、Caiも依然として機能します。一方、挿入図では、紙ベースの反応がいくつか見られます。PANOxはきれいな紫色に発色していますが、Caiの反応は黄色のままで、全くシグナルが得られていません。
ここで何が起こっているのでしょうか？そして、これを修正することは可能でしょうか？私たちのアプローチは、実験計画法を用いることでした。JMPでは、二次モデルとKVCクロスを用いて混合量計画を構築しました。最初のラウンドでは、低コストの混合物から16の成分を検討し、それらの組み合わせをさらに追加することで活性が回復するかどうかを確認しました。
少なくとも、いくつかの組み合わせでは活性がゼロ以上になることが分かりました。このヒートマップを見ると、黄色は活性の増加を示しています。しかし、それはごく少数のケースに限られます。JMPでモデルを収束させて最適な処方を予測するには不十分でした。そこで2回目のラウンドに進み、PANOx配合の何か、つまり理論上はうまく機能している要因が何かあるのではないかと推測します。
これらの成分のいくつかを低コストの混合物に加えました。ここでは、はるかに優れた反応が見られ、モデルを収束させて最適な配合を予測することができました。いくつかをテストしています。左下には、様々な軌跡が表示されています。左上のパネルの一つは、私たちが最もよく使用する主力製品であるPANOxです。
残りの2つは、PANOxとは異なる組み合わせで添加した低コストの製剤です。これらはほぼ同等の効果を発揮していることがわかります。1つか2つは、実際にはもう少し効果が高いかもしれません。なぜでしょうか？興味深いですが、その理由は分かりません。一番上のヒートマップを見ると、それぞれの成分がどれだけ添加されているかがわかります。紺色は何も添加しておらず、黄色は許容される最大値です。
各成分には、何も添加しないか、最大限の効果が得られる最適な配合が存在します。明確な兆候はありません。中央の表は複雑なため、意図的に小さく表示されています。しかし、双方向の相互作用を見ると、モデルによれば有意であると際立ったものがいくつかあります。しかし、専門家がこれらを調べて洞察を得ようとしたとしても、これらの成分がなぜ機能するのかを説明できるような明確なものは見つかりません。また、異なる最適な配合間でも一貫性がありません。
理由はよく分かりません。これは、双方向以上の相互作用による高次の相互作用を示唆しており、これは当然のことです。なぜなら、これらの複雑なシステムには多くの相互作用が含まれているからです。非常に複雑な相互作用です。理由は分からないかもしれませんが、明らかにパフォーマンスの向上に役立っています。
処方4番は、コストの増加がほとんどないという利点があり、先ほどご紹介したデバイスの一部に採用しました。驚くべきことに、この処方は効果を発揮しただけでなく、当社の主力製品であるSPよりも優れた結果を示しました。青と黄色の曲線は最適化された低コスト配合、紫と赤は標準配合です。コストは100分の1に抑えられており、かなり大幅な改善が見られます。
このプレゼンテーションでは時間があまりありませんが、JMPのおかげでここまでたどり着けた点について、いくつか触れておきたいと思います。例えば、JMPの仕組みを少し覗いてみたいと思います。一つは、残差を簡単に分析して系統的誤差をチェックできる機能です。私たちの液体処理装置は、かなり扱いにくいことで有名です。うまく動作する時は素晴らしいのですが、動作しない時は、それがうまく動作していないことに気づかないことが多く、大きな問題となります。
2回目のDOEでは、最初の数反応に活性が見られなかった系統的な反応群が存在することが分かりました。残差プロットはこれを示していますが、残りの反応はきれいにランダムに分布しています。これは機器の誤差だと仮定し、それらを除外して処理を進めると、先ほどお話ししたような良好な最適値を得ることができます。
また、これらの軌跡をどのように取得し、単一のパラメータに基づいて最適化するかについては、あまり触れていませんでした。最適化には様々な方法がありますが、私たちはJMPの機能主成分分析（FPCA）を使用しました。簡単に言うと、これらの様々な曲線を単一のパラメータに絞り込み、それを用いて非常に高い忠実度で曲線を再構成することができます。ほとんどの情報を維持しながら、単一のパラメータに基づいて最適化を行うことができます。
同様のフレームワークを他の用途にも活用しています。一例を挙げましょう。これは、保存安定性に用いられる14種類の成分を用いたDOEです。「これらの物質は使えるのか？ハンヴィーの荷台に1日置いておけば、腐ってしまうのか？」という疑問を検証したかったのです。答えは「はい」です。これらの添加剤を加えることで、このような処理で活性の大部分を回復させることができます。
さらに最近取り組んでいるもう一つのことは、これを拡張することです。先ほど3つのレシピについて触れましたが、これらのレシピを統合したような42個の成分があります。42個の成分全てを対象に実験計画法（DOE）を実施し、「もしかしたら、誰も探索していない最適な領域が他にもあるかもしれない」という可能性を探ろうとしたところ、JMPソフトウェアがクラッシュしてしまいました。統計担当者がエンジニアと協力して、この問題を解決できるかどうか検討しています。しかし、36個の成分であれば、同様の結果が得られました。
残念ながら、エラーのある状態でこれを使用しようとすると、これまで取り組んできた分配の問題がさらに発生してしまいます。ご覧のとおり、分布がきれいにランダムではなく、全く活動がない領域もあります。これはまだ進行中の作業ですが、JMPソフトウェアと計測機器の両方の限界に挑戦できることは、非常に刺激的です。
それでは、謝辞を述べさせていただきます。David Garciaは私たちのグループのポスドクで、素晴らしい研究をし、ここに記載したすべての実験を行いました。また、統計学者のJay Daviesは、JMPを使ったすべての作業と統計分析を行いました。
