I sistemi di espressione acellulare (CFE) sono una serie di metodi che ricostituiscono funzioni cellulari complesse come la trascrizione, la traduzione e il metabolismo al di fuori dei confini di una cellula vivente. I sistemi CFE hanno numerosi usi biotecnologici nei settori della sensoristica, della bioproduzione, della medicina, della ricerca di base e dell'istruzione. La maggior parte dei sistemi CFE è realizzata combinando lisati cellulari con una miscela complessa di eccipienti che ne migliorano l'attività. Sebbene il numero di eccipienti renda difficile l'esplorazione degli spazi combinatori, la sperimentazione ad alto rendimento con la manipolazione acustica dei liquidi rende possibile l'ottimizzazione delle formulazioni se abbinata a un quadro statistico appropriato.
In questo articolo descriviamo il nostro utilizzo del design of experiments (DOE) per ottimizzare le combinazioni di eccipienti per specifici casi d'uso di CFE. Abbiniamo il nostro DOE all'analisi dei dati funzionali (FDA) per ridurre le misurazioni dell'attività nel tempo a metriche facilmente utilizzabili per l'analisi. Gli esempi di DOE di formulazione iniziale vanno da cinque a 14 componenti. Descriviamo inoltre i nostri sforzi per spingerci verso scale più elevate, tentando progetti DOE basati su processi misti con un massimo di 42 componenti, utilizzando un apparato sperimentale che consente di testare 1.536 formulazioni contemporaneamente.
Ciao. Sono Matt Lux dell'US Army Devcom Chemical Biological Center. Vi racconterò di alcuni dei lavori che abbiamo svolto utilizzando il software JMP per la progettazione di esperimenti su sistemi biologici complessi.
Per un contesto più generale, lavoriamo su qualcosa chiamato sistemi di espressione acellulare. In gran parte della biotecnologia, si utilizzano le cellule, che sono piccole macchine fantastiche e straordinarie, ma possono essere molto difficili da manipolare e gestire. Nei sistemi acellulari, invece di manipolare le cellule, si fa crescere un gruppo di cellule, le si rompe, si estrae il loro intestino e si prende quel macchinario molecolare combinato con il DNA che codifica per la funzione che interessa, e poi lo si può usare per svolgere la funzione desiderata.
Per le applicazioni di rilevamento, è possibile posizionare questi elementi su substrati privi di carta e liofilizzarli, per poi reidratarli al momento del bisogno per eseguire la reazione di rilevamento desiderata. Lo abbiamo fatto per diverse applicazioni. A destra, potete vedere: acqua potabile, minacce chimico-biologiche, prestazioni umane.
Abbiamo portato questa tecnologia molto lontano. Abbiamo confezionato queste reazioni in dispositivi fluidici di carta con involucro di plastica e li abbiamo utilizzati in eventi operativi con i soldati per ottenere feedback sull'usabilità e così via. Ora stiamo iniziando a produrli insieme a un partner industriale.
Ci sono diversi vantaggi nel fare questo, ma quello che voglio sottolineare e di cui voglio parlare di più oggi riguarda la sperimentazione rapida. La sperimentazione ad alta produttività di solito utilizza la robotica. Utilizzando la robotica tipica, possiamo aumentare la produzione di questi dispositivi piuttosto bene. A titolo di accenno, abbiamo utilizzato il software JMP per eseguire un DOE per i parametri robotici dello strumento mostrato nel video qui sopra. Ma quando si cerca di modificare i diversi componenti per la ricerca e lo sviluppo di queste reazioni, questo tipo di sistema non è così efficace.
Per dare un po' di contesto, queste reazioni sono estremamente complesse. Esistono tre principali famiglie di ricette, ciascuna composta da 25 componenti. Il componente lisato è il nucleo cellulare, che contiene migliaia di proteine e diversi metaboliti. Non sappiamo ancora a cosa servano molti di questi, come interagiscano e così via. Oltre a ciò, si possono aggiungere decine di altri componenti. Ad esempio, considerando diversi crioprotettori, a poche concentrazioni diverse si ottengono sei miliardi di combinazioni diverse.
Condurre questi esperimenti solo in reazioni liquide, senza carta, in queste strutture di piastre di plastica dotate di piccoli pozzetti che permettono di aggiungere diversi componenti, ha portato a dei progressi, anche noi. Ma nessuno aveva ancora realmente studiato come farlo in presenza di carta, che può alterare l'andamento delle reazioni in modi che non comprendiamo appieno.
Abbiamo impostato un framework per condurre esperimenti ad alta produttività utilizzando il software JMP e alcuni esperimenti per ridurre lo spazio di ricerca a un livello più gestibile. Quindi realizziamo questi 384 biglietti cartacei spot per consentirci di eseguire più reazioni contemporaneamente, utilizziamo la manipolazione acustica dei liquidi per erogare queste diverse reazioni e infine utilizziamo una strumentazione personalizzata che analizza il cambiamento di colore nel tempo ed estrae tali informazioni.
A cosa ci serve? L'argomento principale di cui parlerò è quando abbiamo preso una ricetta a basso costo che non funzionava affatto sulla carta e poi abbiamo utilizzato questo framework per riottimizzarla e farla funzionare sulla carta senza aggiungere costi significativi.
Ci sono due ricette principali. Una si chiama PANOx. È una sorta di ricetta di riferimento per noi e per molti altri nel settore. Poi c'è la seconda, chiamata Cytomim-Cai, che costa circa 100 volte meno, è un po' più semplice e funziona in alcune applicazioni. Ma abbiamo scoperto che non funziona affatto sulla carta. A destra, potete vedere le traiettorie di queste reazioni in liquidi. Sia Cai che PANOx funzionano. PANOx funziona un po' meglio, ma Cai funziona ancora, mentre nell'inserto, vedete alcune reazioni su carta in cui il PANOx ha un bel colore viola chiaro, ma le reazioni Cai rimangono gialle; non si ottiene alcun segnale.
Cosa sta succedendo qui? Possiamo risolverlo? Il nostro approccio è stato quello di utilizzare la progettazione degli esperimenti. In JMP, abbiamo costruito un progetto di quantità di miscela utilizzando un modello quadratico e la croce KVC. Per il primo round, abbiamo esaminato 16 componenti del mix a basso costo, per vedere se l'aggiunta di una combinazione di essi avrebbe potuto ripristinare l'attività.
Abbiamo scoperto che alcune combinazioni forniscono almeno un'attività maggiore di zero. Se si osserva questa mappa termica, il colore giallo indica un aumento dell'attività. Ma solo in pochi casi. Non è stato sufficiente far convergere il modello in JMP per poter prevedere le formulazioni ottimali. Passiamo quindi a un secondo round in cui, ok, beh, forse è qualcosa nel mix PANOx, uno o più fattori che gli consentono di funzionare bene sulla carta.
Abbiamo aggiunto alcuni di questi componenti al mix a basso costo. Qui, osserviamo una risposta molto migliore e siamo in grado di far convergere un modello e prevedere alcune formulazioni ottimali. Ne testiamo alcune. In basso a sinistra, vedete diverse traiettorie. In alto a sinistra, uno di quei pannelli è il PANOx, quello più utilizzato, quello che usiamo di più.
Poi ci sono le altre formulazioni a basso costo con diverse combinazioni di PANOx aggiunte. Come potete vedere, funzionano più o meno altrettanto bene. Una o due funzionano addirittura un po' meglio, forse. Perché? È entusiasmante, ma perché? Beh, non lo sappiamo. Se guardate la mappa termica in alto, questa mostra la quantità aggiunta di ciascuno dei diversi componenti. Il blu navy non è nulla, e il giallo è il massimo consentito.
Per ciascuna delle componenti, esiste una formulazione ottimale che non aggiunge nulla o aggiunge il massimo. Non ci sono indicazioni chiare. La tabella al centro è volutamente piccola perché è complicata. Ma quando osserviamo le interazioni bidirezionali, ce ne sono alcune che si distinguono come significative secondo il modello. Tuttavia, se un esperto le esamina, cercando di ricavarne informazioni, non emerge nulla di chiaro che possa spiegare il motivo per cui queste cose funzionano. Non sono coerenti nemmeno tra le diverse formulazioni ottimali.
Non sappiamo esattamente perché. Questo indica interazioni di ordine superiore tra più di un'interazione bidirezionale, il che è del tutto prevedibile, perché questi sistemi complessi contengono molte interazioni. Molte interazioni complesse. Forse non sappiamo perché, ma è chiaro che ciò contribuisce alle prestazioni.
Abbiamo preso una delle formulazioni, la numero 4, che sostanzialmente aggiungeva un importo insignificante al costo, e l'abbiamo integrata in alcuni dei nostri dispositivi che ho menzionato prima. La cosa entusiasmante è che non solo ha funzionato, ma ha funzionato persino meglio del nostro cavallo di battaglia predefinito, SP. Le curve blu e gialle rappresentano la combinazione ottimizzata a basso costo, mentre quelle viola e rossa rappresentano la combinazione standard. Possiamo osservare un miglioramento piuttosto sostanziale, ma con un costo 100 volte inferiore.
Non ho molto tempo a disposizione in questa presentazione, ma volevo almeno toccare un paio di aspetti che JMP ci ha permesso di approfondire, come ad esempio dare un'occhiata più da vicino. Uno è la possibilità di analizzare facilmente i residui per verificare la presenza di errori sistematici. Il nostro strumento di gestione dei liquidi è notoriamente un po' schizzinoso. A volte, quando funziona, è fantastico. Quando non funziona, non sempre ci si accorge che non sta funzionando, il che è un grosso problema.
Qui, nel secondo DOE che abbiamo condotto, abbiamo visto che c'era un insieme sistematico in cui le prime reazioni non presentavano attività. I grafici dei residui lo mostrano, mentre il resto è ben distribuito e casuale. Ipotizziamo che si tratti di un errore di strumentazione, e possiamo escluderlo e procedere, ottenendo così quegli ottimi valori di cui ho parlato.
Inoltre, non ho parlato di come abbiamo preso queste traiettorie, ottimizzandole poi su un singolo parametro. Ci sono molti modi per farlo, ma quello che abbiamo fatto noi è stato usare l'analisi funzionale delle componenti principali in JMP. In breve, è possibile prendere tutte queste diverse curve e ridurle a un singolo parametro, che può essere utilizzato per ricostituire quella curva con un'elevata fedeltà. Siamo in grado di mantenere la maggior parte delle informazioni, ma di eseguire comunque un'ottimizzazione a parametro singolo.
Abbiamo utilizzato lo stesso tipo di framework anche per altre cose. Faccio solo un esempio. Questo è un altro DOE che utilizza 14 componenti che vengono utilizzati per la stabilità a scaffale. Volevamo chiederci: "È possibile utilizzare queste cose? Se rimangono sul retro di un Humvee per un giorno, moriranno?". La risposta è sì. Aggiungendo questi additivi, è possibile recuperare gran parte di quell'attività con quel tipo di trattamento.
Poi l'altra cosa su cui abbiamo lavorato più di recente è l'espansione di questo. Ho menzionato le tre ricette. Ci sono 42 componenti che in un certo senso costituiscono l'unione di quelle ricette. Abbiamo provato a fare un DOE di tutti i 42 componenti per cercare, "Ehi, forse c'è qualche altra regione ottimale che nessuno ha esplorato". Ha fatto crashare il software JMP. I nostri statistici hanno collaborato con gli ingegneri per vedere se riuscivano a risolvere il problema. Ma con 36 componenti, ci siamo riusciti.
Sfortunatamente, quando lo usiamo con gli errori, riscontriamo più problemi di distribuzione su cui abbiamo lavorato finora, perché potete vedere qui che la distribuzione non è piacevole e casuale. Ci sono regioni in cui non c'è attività. È un lavoro in corso, ma è entusiasmante lavorare sia ai limiti del software JMP che della strumentazione.
Detto questo, mi limiterò a ringraziare. David Garcia, un postdoc del nostro gruppo, ha svolto un lavoro fantastico e ha condotto tutto il lavoro sperimentale descritto qui. Poi Jay Davies, uno statistico, ha svolto tutto il lavoro con JMP e tutte le analisi statistiche.
