Zellfreie Expressionssysteme (CFE-Systeme) umfassen eine Reihe von Methoden, die komplexe Zellfunktionen wie Transkription, Translation und Stoffwechsel außerhalb lebender Zellen nachbilden. CFE-Systeme finden vielfältige biotechnologische Anwendungen in den Bereichen Sensorik, Bioproduktion, Medizin, Grundlagenforschung und Lehre. Die meisten CFE-Systeme basieren auf der Kombination von Zelllysaten mit einer komplexen Mischung von Hilfsstoffen, die die Aktivität verbessern. Die Vielzahl der Hilfsstoffe erschwert zwar die Untersuchung kombinatorischer Möglichkeiten, doch ermöglicht Hochdurchsatzexperimente mit akustischer Flüssigkeitshandhabung die Optimierung der Formulierungen in Verbindung mit einem geeigneten statistischen Rahmen.
Hier beschreiben wir die Anwendung von Versuchsplanung (Design of Experiments, DOE) zur Optimierung von Hilfsstoffkombinationen für spezifische Anwendungsfälle der zellfreien Flüssigkeitsextraktion (CFE). Wir kombinieren unsere DOE mit funktionaler Datenanalyse (Functional Data Analysis, FDA), um Aktivitätsmessungen über die Zeit in direkt analysierbare Metriken zu überführen. Erste Beispiele für Formulierungs-DOE umfassen fünf bis 14 Komponenten. Wir beschreiben weiterhin unsere Bemühungen, größere Maßstäbe zu erreichen, indem wir Mischungs-DOE-Designs mit bis zu 42 Komponenten entwickeln. Unser Versuchsaufbau ermöglicht die gleichzeitige Prüfung von 1.536 Formulierungen.
Hallo. Ich bin Matt Lux vom US Army Devcom Chemical Biological Center. Ich werde Ihnen von einigen unserer Arbeiten zur Verwendung der JMP-Software für die Versuchsplanung komplexer biologischer Systeme berichten.
Zur Erklärung: Wir arbeiten mit sogenannten zellfreien Expressionssystemen. In der Biotechnologie werden häufig Zellen verwendet – faszinierende kleine Maschinen, die jedoch oft schwierig zu handhaben sind. Bei zellfreien Systemen geht man anders vor: Anstatt die Zellen zu manipulieren, werden sie vermehrt, aufgebrochen, ihr Zellinneres entnommen und die darin enthaltenen molekularen Strukturen mit der DNA, die für die gewünschte Funktion kodiert, kombiniert. Anschließend kann man diese Strukturen nutzen, um die gewünschte Funktion auszuführen.
Für Sensoranwendungen können diese Substanzen auf papierlose Träger aufgebracht und gefriergetrocknet werden. Anschließend können sie vor Ort rehydriert werden, um die gewünschte Sensorreaktion durchzuführen. Wir haben dies bereits für verschiedene Anwendungen genutzt. Rechts sehen Sie Beispiele für Trinkwasser, chemische und biologische Bedrohungen sowie die menschliche Leistungsfähigkeit.
Wir haben diese Technologie schon sehr weit entwickelt. Wir haben diese Reaktionen in Papierfluidik-Geräten mit Kunststoffgehäuse untergebracht und sie in Übungen mit Soldaten eingesetzt, um Feedback zur Benutzerfreundlichkeit usw. zu erhalten. Jetzt beginnen wir mit einem Industriepartner mit der Serienfertigung.
Das bietet einige Vorteile, aber der wichtigste, den ich heute hervorheben möchte, ist die Möglichkeit schneller Experimente. Hochdurchsatzexperimente nutzen üblicherweise Robotik. Mit typischer Robotik lässt sich die Produktion dieser Dinge gut skalieren. Nebenbei bemerkt: Wir haben die JMP-Software verwendet, um ein Versuchsdesign (DOE) für die Robotikparameter des im obigen Video gezeigten Instruments durchzuführen. Wenn man jedoch die verschiedenen Komponenten für die Forschung und Entwicklung dieser Reaktionen ändern möchte, ist ein solches System weniger geeignet.
Zur Einordnung: Diese Reaktionen sind extrem komplex. Es gibt im Wesentlichen drei Hauptgruppen von Reaktionsrezepten mit jeweils 25 Komponenten. Die Lysatkomponente ist das Zellinnere mit Tausenden von Proteinen und verschiedenen Metaboliten. Wir wissen noch nicht, welche Funktion viele davon haben, wie sie interagieren usw. Hinzu kommen Dutzende weiterer Komponenten, die hinzugefügt werden können. Allein bei der Auswahl verschiedener Kryoprotektiva ergeben sich beispielsweise bei wenigen Konzentrationsänderungen sechs Milliarden verschiedene Kombinationsmöglichkeiten.
Diese Experimente wurden bereits in flüssigen Reaktionen ohne Papier in Kunststoffplatten mit kleinen Vertiefungen zur Zugabe verschiedener Komponenten durchgeführt. Auch wir haben daran gearbeitet und Fortschritte erzielt. Bisher hat sich jedoch niemand damit befasst, wie man diese Experimente in Gegenwart von Papier durchführt, da dieses die Reaktionsleistung auf noch nicht vollständig verstandene Weise beeinflussen kann.
Wir haben hier ein System für Hochdurchsatzexperimente mit der JMP-Software eingerichtet und einige Experimente durchgeführt, um den Suchraum auf ein überschaubares Maß zu reduzieren. Anschließend haben wir diese 384 Spot-Papier-Tickets erstellt, um eine Vielzahl von Reaktionen gleichzeitig durchführen zu können. Mithilfe akustischer Flüssigkeitshandhabung dosieren wir diese verschiedenen Reaktionen und verwenden schließlich eine eigens entwickelte Instrumentierung, die die Farbveränderung im Zeitverlauf analysiert und diese Informationen extrahiert.
Wozu wollen wir das verwenden? Ich werde hauptsächlich darüber sprechen, wo wir ein kostengünstiges Rezept genommen haben, das auf dem Papier überhaupt nicht funktionierte, und dann dieses Framework verwendet haben, um es so zu optimieren, dass es auf dem Papier funktioniert, ohne dass dabei nennenswerte Kosten entstehen.
Es gibt hier zwei Hauptrezepturen. Die erste heißt PANOx. Sie ist sozusagen unsere Standardrezeptur und wird von vielen anderen in diesem Bereich häufig verwendet. Die zweite, Cytomim-Cai, ist etwa 100-mal günstiger, etwas einfacher und funktioniert in bestimmten Anwendungen. Wir haben jedoch festgestellt, dass sie auf Papier überhaupt nicht funktioniert. Rechts sehen Sie die Reaktionsverläufe in flüssiger Lösung. Sowohl Cai als auch PANOx funktionieren. PANOx funktioniert etwas besser, aber auch Cai funktioniert. Im Detailbild sehen Sie einige Reaktionen auf Papier: PANOx zeigt eine schöne, klare violette Farbe, während die Cai-Reaktionen gelb bleiben; es wird kein Signal erzeugt.
Was ist hier los, und können wir das Problem beheben? Wir haben einen Versuchsplan entwickelt. In JMP haben wir mithilfe eines quadratischen Modells und des KVC-Kreuzes einen Mischungsmengenplan erstellt. In der ersten Runde haben wir 16 Komponenten der kostengünstigen Mischung untersucht, um zu prüfen, ob eine Erhöhung bestimmter Kombinationen dieser Komponenten die Aktivität wiederherstellen könnte.
Wir stellten fest, dass einige Kombinationen zumindest eine Aktivität aufweisen. In dieser Heatmap zeigt die gelbe Farbe eine erhöhte Aktivität an. Allerdings nur in wenigen Fällen. Es reichte nicht aus, das Modell in JMP zu konvergieren, um optimale Formulierungen vorhersagen zu können. Daher gehen wir in einer zweiten Runde vor, in der wir untersuchen, ob ein oder mehrere Bestandteile der PANOx-Mischung die theoretischen Ergebnisse ermöglichen.
Wir haben einige dieser Komponenten zusätzlich zum kostengünstigen Mix verwendet. Dadurch erzielen wir deutlich bessere Ergebnisse und können ein Modell konvergieren lassen sowie optimale Formulierungen vorhersagen. Einige davon testen wir. Unten links sehen Sie verschiedene Verläufe. Oben links ist eines der Diagramme das PANOx-Modell, unser Standardmodell, das wir am häufigsten verwenden.
Dann gibt es noch die anderen, kostengünstigen Formulierungen mit unterschiedlichen PANOx-Zusätzen. Sie funktionieren ähnlich gut. Ein oder zwei wirken vielleicht sogar etwas besser. Woran liegt das? Das ist spannend, aber warum? Nun, wir wissen es nicht. Die Heatmap oben zeigt die jeweilige Zugabemenge der einzelnen Komponenten. Dunkelblau bedeutet „keine Zugabe“, gelb die maximal zulässige Menge.
Für jede Komponente gibt es eine optimale Formulierung, die entweder keinen oder den maximalen Nutzen bringt. Es gibt keine eindeutigen Hinweise. Die Tabelle in der Mitte ist absichtlich klein gehalten, da sie komplex ist. Betrachtet man jedoch die Wechselwirkungen zwischen zwei Faktoren, fallen einige laut Modell als signifikant auf. Versucht ein Experte, diese zu analysieren und daraus Erkenntnisse zu gewinnen, findet er jedoch keine eindeutigen Erklärungen dafür, warum diese Faktoren funktionieren. Sie sind auch nicht konsistent über die verschiedenen optimalen Formulierungen hinweg.
Wir wissen nicht genau warum. Das deutet auf Wechselwirkungen höherer Ordnung hin, die über bidirektionale Interaktionen hinausgehen, was völlig zu erwarten ist, da diese komplexen Systeme eine Vielzahl von Wechselwirkungen aufweisen. Sehr viele komplexe Wechselwirkungen. Wir kennen den Grund vielleicht nicht, aber es verbessert eindeutig die Leistung.
Wir haben eine der Rezepturen, Nummer 4, gewählt, die die Kosten nur unwesentlich erhöhte, und sie in einigen unserer Geräte, die ich bereits erwähnt habe, eingesetzt. Erfreulicherweise funktionierte sie nicht nur, sondern schnitt sogar besser ab als unser Standardprodukt SP. Die blauen und gelben Kurven zeigen die optimierte, kostengünstige Mischung, die violetten und roten die Standardmischung. Wir sehen eine deutliche Verbesserung bei 100-fach geringeren Kosten.
Ich habe in dieser Präsentation nicht viel Zeit, möchte aber zumindest kurz auf einige Dinge eingehen, die uns JMP ermöglicht hat, sozusagen einen kleinen Einblick in die Funktionsweise zu geben. Eines davon ist die einfache Möglichkeit, Residuen zu analysieren, um systematische Fehler aufzudecken. Unser Flüssigkeitshandhabungsgerät ist bekanntermaßen recht empfindlich. Manchmal funktioniert es, was großartig ist. Wenn es aber nicht funktioniert, merkt man es nicht immer, und das ist ein großes Problem.
Im zweiten Versuchsdesign (DOE) stellten wir fest, dass die ersten Reaktionen systematisch keine Aktivität zeigten. Dies lässt sich anhand der Residuenplots veranschaulichen, während die übrigen Reaktionen gleichmäßig und zufällig verteilt waren. Wir gehen davon aus, dass es sich um einen Gerätefehler handelt und können diese Reaktionen ausschließen, um fortzufahren und die von mir erwähnten optimalen Ergebnisse zu erzielen.
Ich habe auch nicht wirklich darüber gesprochen, wie wir diese Trajektorien berechnet, sondern wie wir sie anschließend über einen einzelnen Parameter optimiert haben. Dafür gibt es viele Möglichkeiten, wir haben jedoch die funktionale Hauptkomponentenanalyse in JMP verwendet. Kurz gesagt: Man kann all diese verschiedenen Kurven nehmen und sie auf einen einzigen Parameter reduzieren, mit dem sich die Kurve mit hoher Genauigkeit rekonstruieren lässt. So können wir die meisten Informationen erhalten und gleichzeitig eine Optimierung über einen einzelnen Parameter durchführen.
Wir haben dieses Rahmenwerk auch für andere Zwecke verwendet. Ich nenne hier nur ein Beispiel. Es handelt sich um ein weiteres Versuchsdesign mit 14 Komponenten zur Verbesserung der Lagerstabilität. Wir wollten untersuchen: „Sind diese Substanzen haltbar? Verlieren sie ihre Wirksamkeit, wenn sie einen Tag lang auf der Ladefläche eines Humvees lagern?“ Die Antwort lautet: Ja. Durch die Zugabe dieser Additive lässt sich ein Großteil der Wirksamkeit bei dieser Behandlung wiederherstellen.
Dann haben wir in letzter Zeit noch an der Erweiterung dieses Projekts gearbeitet. Ich erwähnte bereits die drei Rezepte. Es gibt 42 Komponenten, die sich aus der Kombination dieser Rezepte zusammensetzen. Wir haben versucht, eine Versuchsplanung mit allen 42 Komponenten durchzuführen, um herauszufinden, ob es noch andere optimale Bereiche gibt, die bisher unerforscht sind. Dabei stürzte die JMP-Software ab. Unsere Statistiker arbeiten mit den Ingenieuren zusammen, um das Problem zu beheben. Mit 36 Komponenten konnten wir das jedoch erfolgreich umsetzen.
Leider treten bei der Verwendung mit Fehlern vermehrt die bereits bekannten Probleme bei der Dosierung auf, da die Verteilung, wie hier zu sehen, nicht gleichmäßig und zufällig ist. Es gibt Bereiche, in denen keinerlei Aktivität stattfindet. Die Entwicklung ist noch im Gange, aber es ist spannend, sowohl die Grenzen der JMP-Software als auch der Instrumente auszuloten.
Damit komme ich zu den Danksagungen. David Garcia, ein Postdoktorand in unserer Gruppe, hat hervorragende Arbeit geleistet und alle hier beschriebenen Experimente durchgeführt. Jay Davies, ein Statistiker, hat die gesamte Arbeit mit JMP und die statistische Analyse übernommen.
