Les systèmes d'expression acellulaire (CFE) regroupent un ensemble de méthodes permettant de reconstituer des fonctions cellulaires complexes, telles que la transcription, la traduction et le métabolisme, en dehors du contexte d'une cellule vivante. Ces systèmes trouvent de nombreuses applications biotechnologiques dans les domaines de la détection, de la bioproduction, de la médecine, de la recherche fondamentale et de l'enseignement. La plupart des systèmes CFE sont constitués de lysats cellulaires associés à un mélange complexe d'excipients qui en améliorent l'activité. Si le nombre d'excipients rend l'exploration des différentes combinaisons complexe, l'expérimentation à haut débit par manipulation acoustique de liquides permet d'optimiser les formulations grâce à un cadre statistique approprié.
Nous décrivons ici notre utilisation de la méthodologie des plans d'expériences (DOE) pour optimiser les combinaisons d'excipients dans des cas d'utilisation spécifiques de l'extrait de CFE. Nous associons nos DOE à l'analyse des données fonctionnelles (FDA) afin de synthétiser les mesures d'activité au cours du temps en métriques facilement exploitables. Les exemples initiaux de DOE pour les formulations comprennent de cinq à quatorze composants. Nous décrivons ensuite nos efforts pour passer à des échelles supérieures, en réalisant des plans d'expériences de mélanges avec jusqu'à 42 composants, grâce à un dispositif expérimental permettant de tester simultanément 1 536 formulations.
Bonjour. Je suis Matt Lux, du Centre de développement chimique et biologique de l'armée américaine. Je vais vous parler de certains travaux que nous avons menés concernant l'utilisation du logiciel JMP pour la conception d'expériences sur des systèmes biologiques complexes.
Pour vous donner un peu de contexte, nous travaillons sur ce qu'on appelle les systèmes d'expression acellulaires. En biotechnologie, on utilise souvent des cellules, de formidables petites machines, mais difficiles à manipuler. Avec les systèmes acellulaires, au lieu de manipuler les cellules, on les cultive, on les lyse, on prélève leur contenu, et on utilise ensuite ce matériel moléculaire, associé à l'ADN codant pour la fonction recherchée, pour réaliser la fonction souhaitée.
Pour les applications de détection, ces éléments peuvent être déposés sur des supports sans papier, lyophilisés, puis réhydratés au moment voulu pour réaliser la réaction de détection souhaitée. Nous avons utilisé cette méthode pour diverses applications. À droite, vous pouvez voir des exemples : eau potable, menaces chimiques et biologiques, performance humaine.
Nous avons bien avancé dans le développement de cette technologie. Nous avons intégré ces réactions dans des dispositifs fluidiques en papier avec un boîtier en plastique et les avons testés lors d'exercices opérationnels avec des soldats afin d'évaluer leur facilité d'utilisation. Nous commençons maintenant leur fabrication en collaboration avec un partenaire industriel.
Cette approche présente plusieurs avantages, mais celui que je souhaite aborder aujourd'hui concerne l'expérimentation rapide. L'expérimentation à haut débit fait généralement appel à la robotique. Grâce à des systèmes robotiques classiques, nous pouvons facilement augmenter la production de ces dispositifs. Je précise d'ailleurs que nous avons utilisé le logiciel JMP pour réaliser un plan d'expériences (DOE) afin d'optimiser les paramètres robotiques de l'instrument présenté dans la vidéo ci-dessus. Cependant, lorsqu'il s'agit de modifier les différents composants pour la recherche et le développement de ces réactions, ce type de système s'avère moins performant.
Pour vous donner un peu de contexte, ces réactions sont extrêmement complexes. Il existe trois grandes familles de protocoles, chacune composée de 25 éléments. Le lysat, c'est le contenu cellulaire, qui renferme des milliers de protéines et de métabolites divers. On ignore encore le rôle et les interactions de nombre d'entre eux. À cela s'ajoutent des dizaines de composants supplémentaires. Par exemple, avec différents cryoprotecteurs, à quelques concentrations seulement, on arrive à six milliards de combinaisons possibles.
En réalisant ces expériences uniquement en milieu liquide, sans papier, dans des plaques de plastique à petits puits permettant l'ajout de différents composants, des chercheurs, dont nous-mêmes, ont progressé. Cependant, personne n'avait encore étudié comment reproduire ces expériences en présence de papier, qui peut modifier le déroulement des réactions de manières que nous ne comprenons pas encore totalement.
Nous avons mis en place un système permettant de réaliser des expériences à haut débit grâce au logiciel JMP et à des expériences visant à réduire l'espace de recherche à un volume plus gérable. Nous utilisons ensuite des supports de 384 spots pour effectuer simultanément de nombreuses réactions, puis un système de distribution acoustique des liquides pour acheminer ces différentes réactions. Enfin, un instrument spécifique analyse l'évolution de la couleur au fil du temps et extrait les données correspondantes.
À quoi voulons-nous utiliser cela ? Je vais principalement vous expliquer comment nous avons pris une recette à bas coût qui ne fonctionnait pas du tout sur le papier, puis comment nous avons utilisé ce cadre pour la réoptimiser afin qu'elle fonctionne sur le papier sans engendrer de coûts significatifs.
Il y a deux formulations principales. La première, appelée PANOx, est une formulation de référence pour nous et beaucoup d'autres dans le domaine. La seconde, appelée Cytomim-Cai, est environ 100 fois moins chère, un peu plus simple et fonctionne dans certaines applications. Cependant, nous avons constaté qu'elle ne fonctionnait pas du tout sur papier. À droite, vous pouvez observer les trajectoires de ces réactions en phase liquide. Les deux formulations, Cai et PANOx, fonctionnent. PANOx fonctionne légèrement mieux, mais Cai fonctionne également. En revanche, dans l'encart, vous pouvez observer des réactions sur papier où PANOx produit une belle couleur violette nette, tandis que les réactions avec Cai restent jaunes ; aucun signal n'est détecté.
Que se passe-t-il et pouvons-nous y remédier ? Nous avons opté pour une approche par plans d'expériences. Dans JMP, nous avons élaboré un plan d'expériences de dosage de mélange à l'aide d'un modèle quadratique et du croisement KVC. Dans un premier temps, nous avons examiné 16 composants du mélange à faible coût, afin de déterminer si l'ajout de certaines combinaisons de ces composants permettrait de relancer l'activité.
Nous avons constaté que certaines combinaisons présentent une activité non négligeable. Sur cette carte thermique, la couleur jaune indique une activité accrue. Cependant, cela n'est que rare. La convergence du modèle dans JMP n'était pas suffisante pour prédire les formulations optimales. Nous passons donc à une seconde phase où, peut-être, un ou plusieurs éléments du mélange PANox expliquent son bon fonctionnement théorique.
Nous avons ajouté certains de ces composants à la formule à faible coût. On observe alors une bien meilleure réponse, ce qui nous permet de faire converger un modèle et de prédire des formulations optimales. Nous en testons quelques-unes. En bas à gauche, vous pouvez observer différentes trajectoires. En haut à gauche, l'un de ces panneaux représente le PANox, la formule principale que nous utilisons le plus souvent.
Les autres formulations sont économiques et contiennent différentes combinaisons de PANOx. On constate qu'elles sont tout aussi efficaces. L'une ou l'autre est même légèrement plus performante. Pourquoi ? C'est intéressant, mais pourquoi ? Eh bien, nous l'ignorons. La carte thermique en haut de la page indique la quantité de chaque composant ajouté. Le bleu marine représente une quantité nulle, et le jaune, la quantité maximale autorisée.
Pour chaque composant, il existe une formulation optimale qui n'apporte rien ou qui apporte le maximum. Aucune indication claire à ce sujet. Le tableau central est volontairement réduit en raison de sa complexité. Cependant, l'analyse des interactions à deux facteurs révèle que certaines sont significatives selon le modèle. Or, même l'examen par un expert de ces interactions, visant à en tirer des conclusions, ne permet pas de dégager d'explications claires quant à leur fonctionnement. De plus, ces résultats ne sont pas cohérents entre les différentes formulations optimales.
On ignore la raison exacte. Cela suggère des interactions d'ordre supérieur, impliquant plus d'interactions bidirectionnelles, ce qui est tout à fait normal, car ces systèmes complexes comportent de nombreuses interactions. De nombreuses interactions complexes. On ignore peut-être pourquoi, mais il est clair que cela améliore les performances.
Nous avons testé l'une des formulations, la numéro 4, dont le coût supplémentaire était minime, dans certains des appareils que j'ai mentionnés précédemment. De manière surprenante, non seulement elle a fonctionné, mais elle a même surpassé notre formulation de référence, SP. Les courbes bleue et jaune représentent la formulation optimisée à faible coût, tandis que les courbes violette et rouge correspondent à la formulation standard. On constate une amélioration considérable, pour un coût 100 fois inférieur.
Je n'ai pas beaucoup de temps pour cette présentation, mais je voulais au moins aborder quelques points que JMP nous a permis d'obtenir, comme un aperçu de son fonctionnement interne. L'un d'eux est la possibilité d'analyser facilement les résidus pour détecter les erreurs systématiques. Notre instrument de manipulation de liquides est réputé pour sa fragilité. Parfois, quand il fonctionne, c'est parfait. Mais quand il ne fonctionne pas, on ne s'en aperçoit pas toujours, ce qui pose un problème majeur.
Dans le second plan d'expériences que nous avons réalisé, nous avons observé un ensemble systématique de réactions où aucune activité n'était détectée lors des premières. Les graphiques des résidus le confirment, tandis que les résidus suivants sont bien répartis de manière aléatoire. Nous supposons qu'il s'agit d'une erreur d'instrumentation ; nous pouvons donc exclure ces résidus et poursuivre l'analyse, ce qui nous permet d'obtenir les solutions optimales dont j'ai parlé.
Je n'ai pas vraiment expliqué comment nous avons procédé pour obtenir ces trajectoires, puis les avons optimisées sur un seul paramètre. Il existe de nombreuses méthodes, mais nous avons utilisé l'analyse en composantes principales fonctionnelles (ACPF) dans JMP. En résumé, cette méthode permet de réduire toutes ces courbes à un seul paramètre, qui sert ensuite à reconstituer la courbe avec une grande fidélité. Nous conservons ainsi la majeure partie de l'information tout en effectuant une optimisation sur un seul paramètre.
Nous avons également utilisé ce type de cadre pour d'autres projets. Voici un exemple : il s'agit d'un autre plan d'expériences (DOE) utilisant 14 composants pour la stabilité en rayon. Nous voulions savoir si ces composants étaient utilisables et s'ils se détérioraient s'ils restaient une journée à l'arrière d'un Humvee. La réponse est oui. L'ajout d'additifs permet de récupérer la majeure partie de leur activité après ce type de traitement.
L'autre projet sur lequel nous travaillons plus récemment consiste à étendre ce système. J'ai mentionné les trois recettes. Elles sont en quelque sorte combinées en 42 composants. Nous avons tenté de réaliser un plan d'expériences (DOE) sur ces 42 composants afin de déterminer s'il existait une autre région optimale encore inexplorée. Malheureusement, le logiciel JMP a planté. Nos statisticiens collaborent avec les ingénieurs pour tenter de résoudre ce problème. En revanche, avec 36 composants, nous avons réussi à le faire.
Malheureusement, lorsque nous utilisons cette méthode en cas d'erreurs, nous rencontrons davantage de problèmes de distribution, problèmes que nous sommes en train de résoudre. Comme vous pouvez le constater, la distribution n'est ni uniforme ni aléatoire. Certaines zones sont totalement inactives. Ce travail est en cours, mais il est passionnant d'explorer les limites du logiciel JMP et de l'instrumentation.
Sur ce, je tiens à remercier David Garcia, postdoctorant au sein de notre équipe, qui a réalisé un travail remarquable et mené à bien toutes les expériences décrites ici. Enfin, Jay Davies, statisticien, a effectué tous les traitements avec JMP et toutes les analyses statistiques.
