在生物制药工艺开发中，关键工艺参数 (CPP) 和可控工艺参数的表征至关重要。与许多其他行业一样，工艺开发和表征研究始于实验室规模，随后将生产工艺放大到最终生产设施。JMP 作为一款工具，在支持这些研究（从实验设计到工艺建模）方面发挥着核心作用。
在线传感器数据是一种潜在的信息来源，目前在工艺开发和表征研究中尚未得到充分利用。特别是，不同生产规模下微生物代谢谱的比较大多仍停留在探索阶段。对这些数据进行统计分析有助于理解差异，并有助于制定更有效的工艺控制策略。
大家好，感谢各位参加我的讲座。我是 Anne-Catherine Portmann，Lonza 公司微生物工艺开发部门的项目负责人。今天，我将和大家探讨如何利用微生物代谢谱来改进缩小规模模型验证和工艺表征研究。
首先我想简单声明一下。我不会全文朗读，但我想强调的是，我相信今天与大家分享的所有信息都是正确的。出于保密原因，我特别要说明，所有数据都经过了标准化和匿名化处理。
以下是我今天演讲的议程。首先，我会介绍一下龙沙公司，并简要介绍一些生物工艺和工艺表征研究的背景知识。这将有助于理解接下来我将要讲解的三个使用 JMP 的示例。在第一个示例中，我将展示如何应用 JMP Functional Data Explorer 来比较不同规模批次的数据。在第二个示例中，我将以非常标准的方式使用 JMP 来确定某个参数的已验证可接受范围。第三个示例将介绍如何利用 Functional Data Explorer 来最大限度地减少产品相关的杂质。最后，我将总结本次演讲并回答大家的问题。
首先，我想简单介绍一下我所在的公司。龙沙是一家跨国制药公司，主要服务于生物技术和营养领域。右边这张照片是我位于瑞士维斯普的工厂，我在这里工作。
让我们来看一些关于龙沙的数据。您可能已经知道，龙沙是一家拥有约18,000名员工的全球性公司，拥有超过百年的悠久历史。我们在全球设有35多个生产基地，为客户生产创新药物提供支持。维斯普是龙沙最大的生产基地。
在维斯普，微生物生产能力从70升到15,000升不等。当一项新工艺引入龙沙时，首先会从客户那里移交给工艺开发部门。我所在的工艺开发部门位于厂区的中心位置，所有生产环节都围绕在我们周围。这极大地促进了工艺开发和生产规模之间的良好协作。在工艺开发部门，我们正在测试和调整这项新工艺，以降低在目标生产规模下放大生产的风险。
我知道在座各位来自不同的行业，对微生物生物工艺并不熟悉。因此，接下来的几张幻灯片，我将向大家介绍一个典型的微生物生物工艺，以及表征该工艺的典型步骤。
生物工艺由上游部分和下游部分组成。在上游部分，目标蛋白（图中橙色部分）在微生物发酵过程中产生。然后，细胞被分解，细胞碎片在分离过程中被去除。在下游部分，我们去除其他蛋白质，并纯化目标蛋白，直至得到高纯度的最终产品。
发酵是产生目标蛋白的重要步骤。产品的产量和质量都取决于此步骤。蛋白质链中的任何错误都无法在发酵过程中进行纠正。因此，正确控制温度、pH值、溶解氧等输入参数，并密切监测输出指标（例如产品滴度、产品纯度或生物量，即发酵过程中生物反应器中的细胞数量）至关重要。
在过程表征研究（PC研究）中，我们希望了解输入参数对输出属性的影响，并确定属性符合规范的参数范围。理解输入参数和输出属性之间的依赖关系是理解生物过程的关键。
什么是过程表征（简称PC）？过程表征是过程验证的一部分，它包含四个部分。第一部分是风险评估，即选择需要进一步研究的参数。我们根据对过程的了解、历史数据以及参与风险评估人员的经验和专业知识来选择该参数。
第二部分是对缩小规模模型的验证。我们需要缩小规模模型，因为我们无法在实际规模下进行所有实验来研究这些参数。这样做成本太高，而且实验效率也不会很高。在实验室规模下，我们可以并行运行多个反应器，这有助于在实验室中高效地进行实验。然而，实验室规模的仪器必须与生产规模下的仪器性能完全相同，并给出相同的结果。如果结果不一致，我们需要评估这两个规模之间的差异，更详细地了解这些与规模相关的差异，并能够解释这些差异。
在PC研究的下一步中，我们将使用JMP软件设计实验方案，以优化研究数量，然后在实验室进行实验。我们将收集实验输出的所有数据，并在JMP中生成数据表，分析数据以评估参数和属性之间的相互作用，并确定参数范围及其影响。
为什么要进行工艺表征？工艺表征的目的是确保我们在生产过程中获得稳定的产品质量和可重复的产量。就像我们服用药物一样，我们都希望每次都能获得相同的效果。例如，服用止痛药后，我们希望疼痛完全消失。我们不希望第一次服用后疼痛消失，但两天后再次服用同样的药物时，却几乎无效。而第二天服用时，药效又过强。这正是我们希望药物始终保持相同质量和疗效的例子。为了实现这一点，我们需要进行工艺表征和工艺验证。
现在，我将展示一些例子。首先是缩小模型的验证。正如我之前提到的，缩小模型的验证是工艺流程研究中非常关键的一步，它确保实验是在具有代表性的仪器上进行的。在发酵罐或发酵反应器中，我们连接了许多传感器，它们在实验过程中持续记录大量数据。这是一个庞大的信息来源，非常适合用于比较不同规模之间的差异。接下来，我将向大家展示我们如何利用这些数据来探索这些规模差异。
正如我多次提到的，在实验室中使用仪器确实更经济。我们可以在实验室规模上使用高通量设备，这样就能以比在生产规模上进行所有实验更低的成本完成大量实验。通过验证缩小规模的模型，我们还能确定规模相关的差异。
到目前为止，我们主要使用的是离线数据。具体操作如下：我们分别收集实验室规模和生产规模的数据，并进行单因素方差分析。我们使用方差分析（ANOVA）或均值比较来确定这两组实验室规模的批次数据是否具有可比性。
问题在于，当我们使用在线数据时，无法用这种图表进行比较。数据看起来就像图表的右侧部分。有些人凭借专业眼光比较这些曲线，然后说，好的，这些数据具有可比性，或者这些数据完全不同。这种方法的弊端在于，比较数据的人可能会离职，或者一些同事查看数据后会说：“哦，不，我看不出有什么区别”，而你却能看出区别。这并非一种有效的统计数据比较方法。
借助 JMP Functional Data Explorer，我们可以以适当的方式对这些数据进行统计比较，甚至可以确定是否存在聚类。对缩减模型进行定性是将 PC 研究中的范围转化为生产控制策略的关键。如果存在差异，我们可以将该差异转化回去。我将快速演示 JMP Functional Data Explorer 的工作原理，以及我们如何将其应用于稍后的示例。
函数式数据浏览器（Functional Data Explorer）是一个非常优秀的连续数据分析工具。我不会详细解释它的工作原理，因为关于它的工作原理已经有很多讲解，而且目前也有很多相关的讨论。我将重点介绍对我的分析最有用的部分。首先，当我们拥有数据时，需要拟合一个模型。这个模型需要在B样条、P样条、傅里叶变换或小波变换中选择一个。然后，我们需要检查哪个模型更适合我们的数据。
第二步，我们进行函数型主成分分析。如果您之前使用过主成分分析，那么这种方法与之类似，只是处理的是函数数据而非数据点。其核心思想是改变空间结构，使函数之间失去相关性，从而得到我们这里看到的函数形状。这些函数形状可以解释批次间的变异性以及基于均值函数的变异性。例如，这里第一个形状的函数可以解释批次间属性趋势56%的变异。
我们得到的另一种图表是得分图。在得分图中，我们可以选择要比较的成分。在本例中，我们可以选择五个成分。这五个成分分别是五个形状函数，我们可以将它们绘制在 X 轴和 Y 轴上。在这里，我们可以根据数据，观察它们是否沿着 X 轴和 Y 轴进行分组，在本例中，即沿着第一个或第二个成分进行分组。
通过观察，我们已经可以发现，沿着主成分 1，很可能存在两个组，一组位于 X 轴的左侧，另一组位于右侧。为了验证这一点，我们还可以使用控制图。利用控制图，我们生成一个针对主成分函数的控制图。然后在顶部添加不同的尺度。我们可以观察不同尺度下生成的均值，评估尺度差异，并判断均值是否真的相同。
功能数据浏览器允许我们对可比批次进行聚类，并比较尺度均值。这正是我们所需要的，可以用来比较这些属性的数据。
我们来看一个例子。这些数据是真实的，但出于保密原因，我们已对本次演示中的数据进行了匿名化和标准化处理。在这个例子中，我们想比较两个实验室的测量结果（紫色和蓝色的分别为实验室1和实验室2），以及针对特定属性（即启动时间）的生产测量结果。
我们想知道这两个规模中哪一个更适合作为该制造规模的缩小模型。我们运行了功能数据浏览器，得到了一些结果。如果我们查看该功能主成分的特征值，会发现第一个主成分已经可以解释批次间超过 78% 的变异性。第二个主成分的解释力超过 9%，因此我们将把剩余的分析重点放在这两个主成分上。
我们来看一下得分图。在得分图中，我们可以直接看到，在解释批次间大部分变异的功能组件 1 的 X 轴方向上，存在两个聚类：左侧聚类仅包含实验室规模的数据，右侧聚类包含实验室规模 2 的数据以及生产规模的数据，分别用蓝色和绿色点表示。图中存在一些异常值。在组件 2 上，我们无法真正定义两个组。
为了确认这些分组，我们查看了控制图。图中可以看到，代表批次间均值的绿线在蓝点和绿点之间非常接近，这说明实验室规模 2 和生产规模的平均值相近。实验室规模 1 的均值则截然不同，因此该规模对我们来说并非最佳选择。功能数据浏览器 (Functional Data Explorer) 已将实验室规模 2 识别为该属性更具代表性的缩小规模模型。需要说明的是，这仅适用于该属性。对于其他属性，可能需要使用不同的缩小规模模型。我们需要对所有已决定在分析中探索的属性进行验证。
现在我们已经定义了缩减模型，接下来我们将进行PC研究分析的下一部分。在这一步中，我们将设计实验并执行实验，同时考察参数与属性之间的相互作用，以及参数范围和影响判定的数据分析。这两步我们不使用Functional Data Explorer，而是使用JMP，并采用非常标准的实验设计（DoE）方法。
我们为什么要使用实验设计（DOE）？DOE 使我们能够比较参数和属性，并观察它们之间的相关性。事实上，在实验设计中，我们可以识别出各种不同的交互作用：主效应、二次效应和交互效应。我们还可以优化属性。例如，我们可以最大化滴度、最小化某些杂质或最大化某些纯度（即某些质量属性）。我们可以达到特定的目标。我们有很多选择，这些选择确实能帮助我们。在最终的报告中，我们还可以看到参数对属性的影响。借助 P 值，我们可以判断这些影响是否显著。
为了设计合适的模型，我们可以使用 JMP 的“实验设计 (DoE)”菜单，并选择所需的设计。如果对如何操作有任何疑问，我们始终可以使用便捷的“简易实验设计”选项，它能帮助我们逐步完成模型设计。在本例中，我们使用经典的响应面中心复合设计。在这种情况下，我们有一个中心点，它对应于我们的设定点。假设我们的设定点为 35 度。
然后我们称之为操作范围。这个范围包含了探头的精度以及发酵过程中可能出现的微小波动。例如，读数不会是一条直线，而是会略微波动，这是由于探头的精度、添加的营养物质以及发酵罐的温度控制等因素造成的。已知在这个操作范围内，所有数据都将符合规格要求。
现在，我们想知道，如果在过程中出现某种情况，导致短时间内温度与设定值出现微小差异（例如温度升高或降低），或者在整个过程中温度都与设定值存在差异，那么在这种温度变化期间，我们的产品或质量是否仍然符合规格？JMP DoE 不仅帮助我们优化实验室实验次数，还帮助我们理解参数和属性之间的相互作用。
现在，我们正在实验室进行实验，并将所有数据收集到 JMP 的数据表中，然后我们想要构建一个模型。数据收集完成后，我们遵循整洁数据原则，即每行代表一个实验，每列代表一个参数或属性。这是使用 JMP 的标准方法。之后，我们可以使用不同的选项来拟合模型。例如，我们可以将不同的参数放入响应曲面模型中。在这里，我们可以使用 Y 来添加我们想要探索的属性。我们可以选择不同的方法，例如，标准的最小二乘法或逐步回归法等等。
运行此模型后，我们将获得一份报告。在报告中，我们通常会向下滚动查看预测分析器中的结果，以了解参数和属性之间的交互作用。但是，为了做到这一点，并确保我们选择了合适的模型，至关重要的是要专注于模型的评估。这是第一步。这就是为什么 JMP 会在报告中提供大量输出的原因。我们必须真正理解评估结果。例如，报告中包含失拟指标、学生化残差、拟合优度汇总等等。我强烈建议您深入研究这些数据，真正理解其含义，并为您的数据选择最佳模型。JMP 会进行适当的分析并验证拟合模型的质量，从而确保可靠的预测分析研究和药物产品。
正如我之前提到的，属性和参数之间的关系体现在预测分析器中。我们有一个位于中间的设定点。通常情况下，它会到达预测曲线的顶部。这就是工作范围，也就是数据在该属性范围内的位置。在属性范围的边缘和预测分析器曲线的交点处，存在一个更大的范围。这意味着这些是极端点，但数据仍然在规范范围内。这就是我们希望通过预测分析器研究找到的已验证的可接受范围。预测分析器研究还会给出影响值，这取决于预测分析器曲线的形状。曲线越宽，影响越小；曲线越窄，影响越大。属性规范只有在已验证的参数可接受范围内才能得到满足。现在，我将向您展示一个应用示例。
在这个发酵过程的PC研究数据示例中，我们采用逐步回归法，并考虑所有可能的模型选项，构建了一个响应面模型。我们的模型评估满足了相当多的标准，但却始终无法达到拟合优度。我们遇到了拟合优度不足的问题，模型在该范围内拟合效果不佳。我们一直在思考原因。我们与许多专家进行了内部讨论，并深入分析了数据。最终发现，我们可能遇到了响应面模型无法捕捉到的平台期效应，因为它是一个二次模型。我们需要在参数中添加一个三次多项式。我们照做了，并重新运行了分析。
当时，我们满足了所有标准。这里，第一个模型在这里，第二个模型在那里。可以看到，最后发生变化的参数是第一个参数，预测曲线也略有不同。实际上，最后出现了一个平台期。
此时，我们找到了一个符合所有规范的正确模型。我们能够定义经过验证的可接受范围及其影响。正如您在前两个参数中看到的，影响高于第三个参数。现在，我们已将此应用于生产中，并在生产层面使用这些范围进行一些运行测试。
发酵结束后，分析方法色谱图中会出现峰后肩峰，表明存在一些与产品相关的杂质。这些杂质在下游工艺中很难去除。接下来，我将向您展示我们如何利用功能数据浏览器（Functional Data Explorer）来最大程度地减少这些与产品相关的杂质。
正如您在这里看到的色谱图。我们原本预期的是，曲线上升的部分在右侧会以相同的形状下降。但实际上，下降部分却很不平整。这意味着产品的这一部分含有杂质，也就是产品相关的杂质，这些杂质很难在下游工艺中去除。如果我们不去除这些杂质，或者找不到去除它们的方法，问题可能会更加严重，最终产品的质量可能达不到规格要求。
我们现在得到的曲线中出现了一些杂质。我们知道，借助 JMP 功能数据浏览器，我们可以更好地理解曲线形状。正如您之前看到的，我们通过实验设计 (DoE) 来测试不同的参数，并希望了解这些参数是如何产生的，以及如何利用这些信息来解释杂质的出现，并尽可能减少它们。
对我们来说，问题在于功能数据浏览器 (Functional Data Explorer) 提供的一些主成分分析结果并非实际参数，我们无法在实验室中将其调整为具体的、真实的参数。这不像温度那样可以随意改变几度。但在 JMP 功能数据浏览器中，我们有一个非常有用的选项，可以将功能主成分数据转换为实际参数。这就是功能性实验设计 (DoE)。在功能数据浏览器中构建模型时，只需在第一步添加您执行的 DoE 分析即可。这样，JMP 就能将功能主成分 (FPC) 转换回分析器中的实际参数。然后，我们就可以进行转换。我们希望通过这种方法能够去除或减少杂质。
以下是我们具体操作的示例。我们有一个肩峰。这里，我放大了峰值的一部分以便更清楚地观察。峰后肩峰的数值为 0.11，这个数值相当高。这是我们在所有参数都设定好数值后得到的。然后，我们通过在功能性 DoE 分析器中调整每个参数来优化它。我们发现，通过降低第一个参数并增加接下来的两个参数，我们可以将这些杂质的含量减少一半。
这对我们来说确实是一个非常棒的结果，因为去除DSP部分中的这些杂质非常困难，如果我们能在流程早期通过优化一些参数来做到这一点，就能节省大量的时间和金钱。这对我们和我们的客户来说都是一个非常有利的解决方案。这是一个非常好的结果，但我们还需要在实验室进行测试。测试尚未完成。我们还需要评估这样做是否会产生其他问题，例如过度降低其他参数或属性（而我们不希望降低这些参数或属性），或者增加其他方面。
在本次演示中，您可能已经意识到统计学对于工艺表征的重要性。今天，我将向您介绍如何借助 JMP 改进工艺表征，并实现工艺从小规模到生产规模的转移。
作为本次演讲的要点，您可以记住以下四个方面。首先，过程表征能够确保大规模生产过程中产品质量的稳定性和产量的可重复性。其次，借助 JMP 的功能性 DE，我们可以对连续数据进行聚类，从而检测规模差异。第三，JMP 能够识别最佳拟合模型，即使是对于 PC 研究数据等复杂数据也是如此。最后，JMP 的功能性 DoE 可以将 FPC 转化为操作参数，从而帮助理解和优化工艺。
在此，我要衷心感谢所有帮助我准备这次演讲的同事们。特别感谢Sven，是他提出了这次演讲的主题；还要感谢Claire和Ludovic，他们分享了他们的统计学知识；感谢Jonas在演讲准备过程中提供的支持；感谢Romain与我分享了一些数据；感谢所有同事的贡献和思考。最后，我要特别感谢Florian，在过去的几年里，他一直为我们部门解答各种JMP相关问题，无论问题多么复杂或多么愚蠢。
感谢您的关注，希望这些信息对您有所帮助。如果您有任何疑问，欢迎随时提问。如果您身在曼彻斯特，还有其他问题，我们也可以继续探讨。谢谢。
