在慕尼黑舉行的不幸的 2020 年峰會上，我們展示了 JMP 峰會組織者令人難以置信的轉型能力，並展示了 JMP 在高空間分辨率 (NanoSIMS) 質譜圖像分析方面的初步應用。
在本次演講中，我們將介紹自上次報告以來的最新進展。在簡要回顧我們利用動態連結和圖建構器進行的最基本分析流程後，我們將介紹更高級的分析方法，例如聚類分析，最後，我們將展示 JMP Pro Functional Data Explorer 的應用，並示範它如何幫助我們解讀質譜圖。
現在，由於 JMP 17 中新引入的工作流程建構器，我們可以更快地完成許多此類分析。我們以癌症研究（癌腫瘤組織）和利用細菌綠化土壤肥料等為例，展示了相關資料集。對於每項研究，我們都會先簡要介紹其重要性，然後演講的大部分內容將以現場演示的形式呈現我們得出最終結果的步驟。
大家早安。我叫格雷格‧麥克馬洪，是英國泰丁頓國家物理實驗室的首席科學家。今天我將和大家探討使用JMP和JMP Pro分析高空間解析度質譜影像的最新進展。
這次演講的內容是我大約四年前在慕尼黑那次不幸的會議上所做演講的延續。當時新冠疫情爆發，會議迅速轉為線上舉行。那些迅速調整策略並成功舉辦線上會議的人們的能力至今仍令我驚嘆。我很高興今天能與大家在線上線下相聚，並期待在接下來的一周與大家分享我的演講內容並進行交流。
首先，我要談談NanoSIMS，它是我們取得高空間解析度質譜成像的手段。左側是儀器的圖片。全世界大約只有55台左右。它們被用於各種應用。我們的應用大概80%是生物學領域，剩下的20%可能用於物理科學、冶金、材料科學、半導體等領域。
簡而言之，這台儀器的工作原理是什麼？我們產生一束離子，加速並聚焦到目標樣品上。當這束離子撞擊樣品時，傳遞給樣品的能量會使樣品表面的原子和分子被噴射出來。在這個過程中，只有一小部分被噴射出來的物質會被電離。
一旦離子在高靜電場的作用下電離並帶電，我們就可以收集它們，並將它們聚焦到所謂的二級柱中，然後導入磁體。我們使用磁扇形質譜儀。它的工作原理是根據離子的質荷比分離它們，這與棱鏡將光分解成不同波長的原理非常相似。
分離完成後，我們就得到了一個多接收器腔室，裡面有七個偵測器。這七個探測器中，六個安裝在電動小車上，我們可以將它們移動到任何想要的位置。第七個探測器固定在磁鐵的最高半徑處。通常，我們會將質量最大的樣品放置在這個固定探測器上，然後其他六個探測器的位置則根據樣品質量進行相應調整。
在每個探測器前，我們可以取得所謂的高解析度質譜圖，就像這裡展示的一樣。它通常包含多個峰，這些峰表明存在所謂的質量幹擾。我會在演講的最後部分詳細討論這一點。但實際上，這種方法的主要優勢已經列在幻燈片的底部。我們可以得到極高的空間分辨率，可以達到約35奈米。 100奈米是比較常見的分辨率，實現起來並不難。
我們還獲得了很高的質量分辨率，m/Δm 值約為 15,000-20,000。這使我們能夠分離峰，例如您在此處的質譜圖中看到的峰。由於它是一種質譜技術或二次離子質譜 (SIMS) 技術（我們稱之為二次離子質譜），因此我們獲得了極高的靈敏度，可達到 ppm 和 ppb 等級。
今天我要和大家分享幾個我們推進專案的案例研究。上次我談到了我們如何將其應用於癌症研究，今天就不贅述了。我的第一個案例會很簡單，它展示了我們如何將工作流程建構器整合到我們的工作流程中。這簡直是天賜之物。
我要講的第一個案例研究是關於我們用來促進植物生長的氮肥及其對氣候變遷的影響。在全球範圍內，固定氮的可用性確實限制了農業生產。不幸的是，我們經常使用合成氮肥，而這些肥料在生產過程中會產生氨和一氧化二氮，造成大氣污染。它們還會產生煙霧，並在生產過程中造成其他污染。一旦施用，這些肥料實際上會導致生態系統酸化和水體硝化，總而言之，它們對氣候變遷有害。
大約三、四十年前，人們發現某些細菌具有驚人的能力，它們能夠從大氣中吸收惰性氮（N₂），並將其固定轉化為氨，然後釋放到植物體內，用於合成氨基酸、葉綠素和蛋白質。實際上，這種方法幾乎可以取代我們之前提到的那些有害的合成氮肥。
然而，先前從未有人在植物的微觀到奈米尺度上證實過這種現象。雖然已經有許多整體分析表明存在這種現象，但我們希望以更高的空間解析度對其進行更詳細的觀察。
本次示範將展示我們如何從生長於氮氣濃度為 15 的環境中的植物（在本例中為玉米）上採集葉片，並且未施用任何其他合成肥料。不存在其他可能的 ¹⁵N₂ 來源。或許我應該稍微解釋一下。 ¹⁵N 是氮的一種重同位素。其自然比例約為 0.0037%。我們現在所做的，是將植物生長在幾乎 100% 的 ¹⁵N₂ 環境中，而不是 0.0037% 的 N₂ 環境中。我們的想法是使用質譜儀來檢測植物中的 ¹⁵N。
我想在此總結我們的第一層分析，以及我們如何使用 JMP Workflow Builder 來實現這一目標。我們的原始資料檔其實非常簡單。它是一個 CSV 文件，包含兩列定義像素位置，以及七列（或更多）包含我們測量的各種品質計數。
通常，如果我們要分析同位素比值，首先會做的就是取構成該比值的兩個質量數，然後插入一列來記錄同位素比值。我們可以進入圖形生成器，重建我們在這裡看到的離子圖像。這張圖是植物某一部分的碳氮離子圖。您可以看到這些不同的細胞器。這是植物細胞核。這些是我們所說的葉綠體。
這張圖是氮同位素比值圖，圖中有一個顏色標尺。最深的藍色代表天然氮同位素比值，也就是我們預期普通氮元素所呈現的比值。高於這個顏色的所有比值都代表¹⁵N含量升高，在這種情況下，這些¹⁵N只能來自植物生長過程中使用的¹⁵N₂氣體。
顯然，我們現在有證據表明，這些細菌（種子已被接種這些細菌）已經完成了它們的使命，它們將氮元素固定在植物上並將其分佈到整個植物體內。但我們也可以產生一些數據。觀察各種計數的分佈非常有用，尤其要注意異常值出現的位置。
我按照以前的方法計時，也就是手動完成所有步驟。走到螢幕上顯示的這一步大約需要 3 分鐘。但現在，使用 Workflow Builder，只需要大約 5 秒鐘。如果我們每天要處理 20 個這樣的文件，我們就能節省大量時間，每天大約可以節省 45 分鐘到 1 小時。一個月一年下來，節省的時間就相當可觀了。
我來做個簡單的演示，給你們看是什麼樣子。我們打開一個最近打開的文件，就選這個。正如我所說，這就是原始文件的樣子。兩列，X，Y。它們分別代表像素位置和每個質量塊的計數。
現在我依序點擊「檔案」、「開啟最近使用的檔案」、「第一部分」、「工作流程建構器」。這就是我們的工作流程建構器。我稍微縮小一下視窗。我們一步一步來。首先插入一個新列，標題為「氮同位素比值」。然後輸入公式，計算比值。這就是我們原始的CN影像。這和我之前展示的第一張圖像一樣，只不過幻燈片上顯示的是彩色圖像，而它實際上是灰階圖像。
這是氮同位素比值圖。我們可以用分佈圖和簡單的多元統計分析來結束今天的分析，包括散佈圖矩陣和熱圖。我們看到，這些特定細胞器的比值較高。這些細胞器就是我們所說的葉綠體。葉綠體是負責光合作用的細胞器。
氮似乎優先流向葉綠體，這幾乎是雙贏之舉，因為氮現在優先用於支持葉綠體的生長和功能。而葉綠體，正是從大氣中吸收二氧化碳並將其轉化為能量，驅動植物生長的細胞器。從應對氣候變遷的角度來看，這其實是雙贏之舉。我們減少了土壤對合成氮肥的需求，也可能正在幫助吸收大氣中的二氧化碳。
既然來了，我就再做一件事。有趣的是硫訊號中這些異常值很高。我們把它們選出來。正如你所看到的，被選中的樣本都變成了粉紅色。這些異常值主要出現在葉綠體中，有些葉綠體出現的頻率較高一些。至於原因，我還不太確定，這可能是時間效應。
但這意義重大，因為固氮反應的發生需要一種富含硫的酵素的輔助。這對於分析這個特定樣本來說是一個額外的驚喜。
這只是使用工作流程建構器進行的快速初步分析，它可以節省大量時間。接下來，我會關閉這裡的所有內容，包括剛才的分析，然後回到 PowerPoint，繼續下一張投影片。我剛剛示範的這部分內容是硫優先進入葉綠體，從而促進固氮反應的發生。
這其實是一個相當簡單的分析，但有時我們會遇到一些需要更複雜分析的情況。我要舉的第二個例子是我們所進行的一項關於硒蛋白的研究。如果你去保健品商店，你可能看過專門擺放硒補充劑的區域。
這是一個非常有趣的領域，因為它仍處於起步階段。關於硒蛋白在體內如何發揮作用，我們已經了解了很多，但仍有許多未知之處。目前已經有一些研究提出並有證據支持這些觀點，例如硒蛋白可以保護大腦，有效增強免疫系統。它們可能具有抗氧化特性，有助於生殖，輔助甲狀腺功能，並且還具有抗突變作用，這有助於防止DNA損傷。
本研究旨在解答的一個問題是：硒蛋白是否真的與DNA結合，進而幫助保護DNA的完整性？值得一提的是，我們採用的是高空間解析度質譜成像技術，而這項技術是目前少數能夠實現這一目標並取得相當不錯效果的技術之一。
硒蛋白的問題在於，它們在人體內含量本來就非常非常低。為了方便起見，人們可能會說：“我們再補充一點就行了”，但實際上這樣做並不可取，因為體內硒含量過高也會導致硒中毒。在培養皿中研究人為添加過量硒的樣本，並不能提供太多有價值的資訊。
我們使用了這些硒前體，這些都是你在保健品瓶子上常見的成分。我們在培養基中添加了300納摩爾的這些同位素標記的硒蛋白前體，例如76富硒甲基硒代半胱氨酸、77富硒硒蛋氨酸或82亞硒酸鈉。
我必須強調，我這裡所說的同位素，都是穩定同位素。它們不具有放射性，也不像其他同位素那樣具有任何危險性。它們都是完全安全的。
我們在培養基中添加了這些物質，也添加了¹⁵N胸苷。 ¹⁵N是我們的朋友，它是氮的重同位素。這種胺基酸會選擇性地標記DNA。我們希望透過這個雙標記實驗觀察到的是，高氮比和高硒比之間是否存在相關性，反之亦然，或者可能根本沒有相關性。
如果我們看剛採集到的初始影像，也就是使用先前的工作建構器產生的影像，會發現硒的含量非常低。這可能並不出乎意料，因為硒的含量本來就很低，即使我們進行了這麼長時間的計數也是如此。這張影像左側顯示的是硒的比率影像。
這大概花了一天半到兩天的時間進行影像擷取，主要是收集樣品在被主離子束掃描時的計數資料。當我們產生比值影像時，可以看到灰色區域裡有很多缺失資料。這裡面可能隱藏著很多我們不容易直接觀察到的資訊。
這張圖像基本上只有兩個細胞。這是碳氮圖，主要展示的是細胞的生物量。其他部分，也就是它們之間的暗物質，都是包埋樹脂。這些樣本被包埋在聚合物樹脂中，然後用鑽石刀切成非常薄的片。我們看到計數很低。
甚至在我們進一步研究之前，我們就想到：「或許透過影像分箱來犧牲一些空間分辨率，換取更多的計數，效果會更好。」我現在意識到，我正在把 JMP 變成一款影像分析軟體，這原本並非我的初衷。但它擁有如此強大的動態連結功能。兩者結合得非常完美。
我現在要把這個視窗拉回去關上。我得感謝 Julian Paris。去年，我們午休的時候討論過如何整理圖片。我簡單回顧一下。現在我們已經把這個功能整合到工作流程建構器裡了。讓我把這張圖截下來。
這是原始數據。分箱的訣竅在於兩步驟操作。這裡我不會推導同位素比值。但接下來我們要做的是選擇 X 列和 Y 列。然後進入“實用工具”選項卡，並建立一個分箱公式。我將選擇“分割點”，並將資料分成 4x4 等寬的箱子。
我要使用等分箱。偏移量設為零就可以了。把它改成 4，好的，然後全部設為 X 軸，再建立公式列。這樣我們就有了兩列，分別是 X 軸分箱列和 Y 軸分箱列。我們轉到表格，找到匯總表，我還想調整所有計數列，所以我要選取所有這些列。
在“統計”選項卡下，我想對所有內容進行求和。現在我要把所有像素的計數都加到這個 4x4 的儲存格中。這部分可能不太明顯，因為我們要按 X 軸和 Y 軸分組。好的。現在我們有了分組後的圖像，可以把它顯示在「圖表產生器」中。圖表和 X、Y 軸。我們現在先用 CN 值著色，所以…因為它是分組後的，所以我們把標記的大小稍微調大一點。
現在我們又有了四個計數。這裡的座標軸刻度有點複雜。不過，我覺得還是值得展示一下，以防其他人也遇到類似的問題，因為我們剛開始操作的時候，其實沒有那麼明顯。我先關掉這個窗口，然後回到 PowerPoint。
影像分箱完成後，我們計算了氮同位素比值和硒同位素比值。我們得到了所有元素的分佈圖和熱圖。在觀察熱圖時，我們發現了一些異常之處。硒同位素比值似乎與77硒和80硒都呈負相關。分子和分母都呈現負相關，這似乎不太合理。照理說應該是77硒和80硒呈負相關，但事實並非如此。
我們開始感到疑惑。我們真正好奇的是硒同位素比值及其分佈中出現的這些異常值。我們也注意到氮同位素比值中存在著許多異常值。但這並沒有讓我們太擔心，因為我們知道計數率更高。基本上，根據經驗，我們知道透過注射¹⁵N胸苷，尤其是在微摩爾濃度下，可以獲得這種水平的同位素比值。但對於硒同位素比值，我們並不確定。這完全是未知領域。
於是我們決定：「讓我們更仔細地看看這些異常值。」我們進行了穩健擬合異常值檢驗，發現其中大部分實際上已被穩健擬合演算法識別為異常值。
移除這些因素後，我們重新繪製了熱圖和散佈圖矩陣，現在情況似乎更合理了。硒含量為 77 的樣本與此比率值呈現微弱的正相關，而硒含量為 80 的樣本則略為負相關¹。這樣就更符合實際情況了。
當時我們就想，「不如試試看個簡單的聚類分析吧。」我們照做了。我們做了個簡單的K均值聚類，只考察了三個變數。非常簡單：磷、硒同位素比值和氮同位素比值。
我們希望發現，或至少根據我們的假設，應該存在一個硒含量高、氮含量高的簇，在這種情況下，硒蛋白確實與 DNA 結合，以幫助保護 DNA 免受某些損傷。
但我們查看平行圖，卻從未發現這種情況。要麼一個值高於另一個值，要麼反之亦然，要麼兩者大致相同，但數值都很低。這是我們第一次意識到，或許我們的模型行不通，或者我們的假設是錯的。
當我們分析這些硒同位素比值的異常值時，發現它們都與極低的80硒含量相關。實際上，它們的77硒含量應該會更低一些。事實上，它們基本上都是嵌入在基質或包埋樹脂中。
這讓我們想到：「我們必須更進一步，因為所有這些包埋樹脂都會影響我們的分析結果。我們必須去除它們。」這很容易做到。我們可以再做一次快速的聚類分析，基本上只用拷貝數（CN）和其他幾個指標，進行兩次聚類。透過高拷貝數（CN）值，我們可以明顯地將所有這些樹脂分離出來，只留下細胞。我們可以從中建立一個子集表，得到一個新的資料表進行後續分析。
這就得到了散點圖矩陣和熱圖，現在我們來看看硒同位素比值。我們看到，在 80 處，它是負相關；在 77 處，則是更強的正相關。現在一切都說得通了。但我們真正感興趣的是硒同位素比值和氮同位素比值，現在它們顯示出完全的負相關。這意味著我們之前認為的情況並非如此。要研究其他方面，我們需要觀察數百個這樣的細胞。
我們現在有了完整的流程建構器，它整合了影像的 4x4 分區，並使用了三次圖表建構器來處理三種不同的品質、CN 值、硒同位素比值、氮同位素比值、分佈情況、首次多元統計分析、異常值分析、K-均值聚類和平行座標圖。 K-均值聚類用於分割細胞。
新的數據表已透過圖表建構器建立。我們可以繼續進行多元統計分析。至此，我們的工作就完成了。不過，我們也加入了另一個 K-均值聚類圖和平行圖。
不如就示範一下它的工作原理，因為它挺有意思的。我們依序點擊“文件”、“打開最近使用的文件”，這就是這個文件。現在我們要開啟「工作流程建構器」的最近使用的檔案。這是第二部分，就到這裡。我們啟動它，然後即時觀察它的運作。
這裡依序是第一組影像、第二組、第三組影像、分佈圖、散佈圖矩陣和異常值分析。接下來是散點圖、K均值聚類和資料子集影像。最後是最後一個散佈圖矩陣。現在只需直接打開文件即可運行。這樣可以節省大量時間。
這樣很好，因為我可以開發這些東西，然後發給我的同事，這樣她查看數據的時候就不用做這麼多操作了。她只需要點擊“運行”，所有數據就都顯示出來了。好了，我們把所有東西都關掉吧。
最後還有一件事。今天是1月份，但到了3月份…實際上，這是倒數第二件事。是的，我忘了。完成所有這些之後，我們對那部分資料進行了更多的K均值聚類。同樣，從平行圖中我們可以看到，當我們觀察所有不同的聚集時，完全沒有發現高硒或高氮的跡象。
我會分別進行三個最小和三個最大十個簇的分析，然後只選擇根據CCC標準篩選出的最佳簇。但無論哪種情況，都沒有發現硒和氮含量高的簇。
我們的結論是，至少就直接而言，沒有證據表明這些硒蛋白僅僅透過空間上的關聯就能保護DNA。但它們可能透過某種間接機制發揮保護作用，但這遠遠超出了我們此次研究的範圍。
最後，正如我所說，現在才一月底。希望到三月份，我能就此發表更多看法。但我認為我們可以這樣利用函數式資料瀏覽器來幫助我們進行另一種所需的分析。
我一開始就給你們展示了每個探測器收集到的高解析度質譜圖。我們採集這些譜圖是因為在設定探測器時，我們需要知道實際分析的是哪個質量，因為在許多情況下，會存在大量的質量幹擾。
剛才我在探測器端的這個區域進行了放大，分離出的離子束穿過一組偏轉板，這些偏轉板會將聚焦的二次離子束掃描通過一個狹縫，然後進入探測器。這個離子束的直徑比狹縫的寬度窄。你可以看到，當偏轉幅度很大時會發生什麼。離子束實際上並沒有擊中探測器；它更多地擊中了狹縫的邊緣，而不是到達探測器。
偏轉路徑使粒子偏轉得更厲害，粒子開始進入狹縫並向偵測器運動，因此計數開始上升。當粒子完全進入狹縫後，計數基本上會形成一個平坦的峰值，然後開始下降。也可能出現來自另一個粒子的第二個峰值。這就是我們在這裡看到的。計數再次下降，最後出現第三個峰值。
在分析過程中，我們會選擇想要偵測的峰值，並設定偏轉電壓，使只有該峰值的訊號能夠通過偵測器。如果設定不當，則表示採集到的所有資料基本上都無效。
對於許多元素，例如¹⁵N和我們經常使用的¹³C，我們都知道它們的譜圖是什麼樣的。但對於硒來說，要確定我們確實探測到的是硒，這確實是一個相當大的挑戰，尤其是在計數率如此之低的情況下。
但當我仔細研究這些數據，並開始使用功能數據瀏覽器（Functional Data Explorer）時，我們討論小波的應用時，我首先註意到的是，這些頻譜看起來幾乎與哈爾小波完全相同。此外，由於我們設定了閾值和偵測器增益，以確保幾乎沒有電子背景幹擾，並且響應保持一致，因此基本上沒有背景雜訊。
我們必須這樣做，因為我們一直在測量同位素比值，但我們使用的是兩個不同的探測器。如果這兩個偵測器沒有進行精確的相互校準，我們測量正確同位素比值的能力就會降低。
基本上，我們只需要知道其中一個峰的位置以及它對應的元素。在這個例子中，我知道這個寬峰是¹²C和¹⁴N。而這個峰是¹²C、¹³C和¹H的一部份。這三個峰的元素豐度總和為26。
如果我們知道其中一個是什麼，就可以透過品質差推算出另一個是什麼。這個標尺並不重要，因為我們始終關注的是品質差。我們可以校準它以使其始終保持精確，但這需要花費大量的精力和時間。
如果我們知道其中一個峰值是什麼，我們就可以計算出其他峰值是什麼，它們之間的差異是多少，然後將其與我們現有的程式關聯起來。本質上，我們可以輸入我們認為樣本中存在的所有元素，程式會輸出所有可能的結果，這些結果加起來等於樣本的質量，以及與特定峰值的差異。
如果我們能利用FDE像反捲積一樣把這些幹擾都分離出來，這對我們來說將是莫大的福音，尤其是在一些質量較大的星系中，幹擾更多，也更難分辨。目前我只能說這麼多。不過，等到會議召開的時候，我應該會有更多訊息，或許還能舉些例子。
但現在，我只想特別感謝幾位同事。首先是永續氮基金會的戴維·登特博士，以及諾丁漢大學的埃里克·默奇教授和泰德·科金教授。他們在GD細菌固氮作用的首個案例研究中發揮了重要作用。其次是哈佛醫學院的黛安漢迪博士和克勞德勒切內教授。他們對硒蛋白的研究也至關重要。最後，也要感謝我在英國國家物理實驗室（NPL）的NiCE-MSI的所有同事。
令人悲痛的是，我想告訴大家，泰德和克勞德已經過世了。這對科學界來說是一個巨大的損失，但我們會透過這次演講以及未來更多的演講來紀念他們。非常感謝大家，如果您有任何問題，我很樂意為您解答。
