在慕尼黑举行的不幸的 2020 年峰会上，我们展示了 JMP 峰会组织者令人难以置信的转型能力，并展示了 JMP 在高空间分辨率 (NanoSIMS) 质谱图像分析方面的初步应用。
本次演讲中，我们将介绍自上次报告以来取得的最新进展。在简要回顾我们利用动态链接和图构建器进行的最基本分析流程后，我们将介绍更高级的分析方法，例如聚类分析，最后，我们将展示 JMP Pro Functional Data Explorer 的应用，并演示它如何帮助我们解读质谱图。
现在，得益于 JMP 17 中新引入的工作流构建器，我们可以更快地完成许多此类分析。我们以癌症研究（癌肿瘤组织）和利用细菌绿化土壤肥料等为例，展示了相关数据集。对于每项研究，我们都会先简要介绍其重要性，然后演讲的大部分内容将以现场演示的形式呈现我们得出最终结果的步骤。
大家早上好。我叫格雷格·麦克马洪，是英国泰丁顿国家物理实验室的一名首席科学家。今天我将和大家探讨使用JMP和JMP Pro分析高空间分辨率质谱图像的最新进展。
这次演讲的内容是我大约四年前在慕尼黑那次不幸的会议上所作演讲的延续。当时新冠疫情爆发，会议迅速转为线上举行。那些迅速调整策略并成功举办线上会议的人们的能力至今仍令我惊叹。我很高兴今天能与大家在线上线下相聚，并期待在接下来的一周里与大家分享我的演讲内容并进行交流。
首先，我要谈谈NanoSIMS，它是我们获取高空间分辨率质谱成像的手段。左侧是仪器的图片。全世界大约只有55台左右。它们被用于各种应用。我们的应用大概80%是生物学领域，剩下的20%可能用于物理科学、冶金、材料科学、半导体等领域。
简而言之，这台仪器的工作原理是什么？我们产生一束离子，加速并聚焦到目标样品上。当这束离子撞击样品时，传递给样品的能量会使样品表面的原子和分子被喷射出来。在这个过程中，只有一小部分被喷射出来的物质会被电离。
一旦离子在高静电场的作用下电离并带电，我们就可以收集它们，并将它们聚焦到所谓的二级柱中，然后再导入磁体。我们使用磁扇形质谱仪。它的工作原理是根据离子的质荷比分离它们，这与棱镜将光分解成不同波长的原理非常相似。
分离完成后，我们就得到了一个多接收器腔室，里面装有七个探测器。这七个探测器中，六个安装在电动小车上，我们可以将它们移动到任何想要的位置。第七个探测器固定在磁体的最高半径处。通常，我们会将质量最大的样品放置在这个固定探测器上，然后其他六个探测器的位置则根据样品质量进行相应调整。
在每个探测器前，我们可以获取所谓的高分辨率质谱图，就像这里展示的一样。它通常包含多个峰，这些峰表明存在所谓的质量干扰。我会在演讲的最后部分详细讨论这一点。但实际上，这种方法的主要优势已经列在幻灯片的底部。我们可以获得极高的空间分辨率，可以达到约35纳米。100纳米是比较常见的分辨率，实现起来并不难。
我们还获得了很高的质量分辨率，m/Δm 值约为 15,000-20,000。这使我们能够分离峰，例如您在此处的质谱图中看到的峰。由于它是一种质谱技术或二次离子质谱 (SIMS) 技术（我们称之为二次离子质谱），因此我们获得了极高的灵敏度，可达到 ppm 和 ppb 级别。
今天我要和大家分享几个我们推进项目的案例研究。上次我谈到了我们如何将其应用于癌症研究，今天就不赘述了。我的第一个案例会很简单，它展示了我们如何将工作流构建器集成到我们的工作流程中。这简直是天赐之物。
我要讲的第一个案例研究是关于我们用来促进植物生长的氮肥及其对气候变化的影响。在全球范围内，固定氮的可用性确实限制了农业生产。不幸的是，我们经常使用合成氮肥，而这些肥料在生产过程中会产生氨和一氧化二氮，造成大气污染。它们还会产生烟雾，并在生产过程中造成其他污染。一旦施用，这些肥料实际上会导致生态系统酸化和水体硝化，总而言之，它们对气候变化有害。
大约三四十年前，人们发现某些细菌具有惊人的能力，它们能够从大气中吸收惰性氮（N₂），并将其固定转化为氨，然后释放到植物体内，用于合成氨基酸、叶绿素和蛋白质。实际上，这种方法几乎可以替代我们之前提到的那些有害的合成氮肥。
然而，此前从未有人在植物的微观到纳米尺度上证实过这种现象。虽然已经有很多整体分析表明存在这种现象，但我们希望以更高的空间分辨率进行更详细的观察。
本次演示将展示我们如何从生长于氮气浓度为 15 的环境中的植物（在本例中为玉米）上采集叶片，并且未施用任何其他合成肥料。不存在其他可能的 ¹⁵N₂ 来源。或许我应该稍微解释一下。¹⁵N 是氮的一种重同位素。其自然比例约为 0.0037%。我们现在所做的，是将植物生长在几乎 100% 的 ¹⁵N₂ 环境中，而不是 0.0037% 的 N₂ 环境中。我们的想法是使用质谱仪来检测植物中的 ¹⁵N。
我想在此总结一下我们的第一层分析，以及我们如何使用 JMP Workflow Builder 来实现这一目标。我们的原始数据文件其实非常简单。它是一个 CSV 文件，包含两列定义像素位置，以及七列（或更多）包含我们测量的各种质量计数。
通常，如果我们要分析同位素比值，首先会做的就是取构成该比值的两个质量数，然后插入一列来记录同位素比值。我们可以进入图形生成器，重建我们在这里看到的离子图像。这张图是植物某一部分的碳氮离子图像。您可以看到这些不同的细胞器。这是植物细胞核。这些是我们所说的叶绿体。
这张图是氮同位素比值图，图中有一个颜色标尺。最深的蓝色代表天然氮同位素比值，也就是我们预期普通氮元素所呈现的比值。高于这个颜色的所有比值都代表¹⁵N含量升高，在这种情况下，这些¹⁵N只能来源于植物生长过程中使用的¹⁵N₂气体。
显然，我们现在有证据表明，这些细菌（种子已被接种这些细菌）已经完成了它们的使命，它们将氮元素固定在植物上并将其分布到整个植物体内。但我们也可以生成一些数据。观察各种计数的分布情况非常有用，尤其要注意异常值出现的位置。
我按照以前的方法计时，也就是手动完成所有步骤。走到屏幕上显示的这一步大约需要 3 分钟。但现在，使用 Workflow Builder，只需要大约 5 秒钟。如果我们每天要处理 20 个这样的文件，就能节省大量时间，每天大约可以节省 45 分钟到 1 小时。一个月一年下来，节省的时间就相当可观了。
我来做个简单的演示，给你们看看是什么样子。我们打开一个最近打开的文件，就选这个。正如我所说，这就是原始文件的样子。两列，X，Y。它们分别代表像素位置和每个质量块的计数。
现在我依次点击“文件”、“打开最近使用的文件”、“第一部分”、“工作流构建器”。这就是我们的工作流构建器。我稍微缩小一下窗口。我们一步一步来。首先插入一个新列，标题为“氮同位素比值”。然后输入公式，计算比值。这就是我们原始的CN图像。这和我之前展示的第一张图像一样，只不过幻灯片上显示的是彩色图像，而它实际上是灰度图像。
这是氮同位素比值图。我们可以用分布图和简单的多元统计分析来结束今天的分析，包括散点图矩阵和热图。我们看到，这些特定细胞器的比值较高。这些细胞器就是我们所说的叶绿体。叶绿体是负责光合作用的细胞器。
氮似乎优先流向叶绿体，这几乎是双赢之举，因为氮现在优先用于支持叶绿体的生长和功能。而叶绿体，正是从大气中吸收二氧化碳并将其转化为能量，驱动植物生长的细胞器。从应对气候变化的角度来看，这实际上是双赢之举。我们减少了土壤对合成氮肥的需求，而且可能还在帮助吸收大气中的二氧化碳。
既然来了，我就再做一件事。有趣的是硫信号中这些异常值很高。我们把它们选出来。正如你所看到的，被选中的样本都变成了粉红色。这些异常值主要出现在叶绿体中，有些叶绿体出现的频率更高一些。至于原因，我还不太确定，这可能是时间效应。
但这意义重大，因为固氮反应的发生需要一种富含硫的酶的辅助。这对于分析这个特定样本来说是一个额外的惊喜。
这只是使用工作流构建器进行的一次快速初步分析，它能节省大量时间。接下来，我会关闭这里的所有内容，包括刚才的分析，然后返回 PowerPoint，继续下一张幻灯片。我刚才演示的这部分内容是硫优先进入叶绿体，从而促进固氮反应的发生。
这其实是一个相当简单的分析，但有时我们会遇到一些需要更复杂分析的情况。我要举的第二个例子是我们开展的一项关于硒蛋白的研究。如果你去保健品商店，你可能见过专门摆放硒补充剂的区域。
这是一个非常有趣的领域，因为它仍处于起步阶段。关于硒蛋白在体内如何发挥作用，我们已经了解了很多，但仍有很多未知之处。目前已经有一些研究提出并有证据支持这些观点，例如硒蛋白可以保护大脑，有效增强免疫系统。它们可能具有抗氧化特性，有助于生殖，辅助甲状腺功能，并且还具有抗突变作用，这有助于防止DNA损伤。
本研究旨在解答的一个问题是：硒蛋白是否真的与DNA结合，从而帮助保护DNA的完整性？值得一提的是，我们采用的是高空间分辨率质谱成像技术，而这项技术是目前少数几种能够实现这一目标并取得相当不错效果的技术之一。
硒蛋白的问题在于，它们在人体内含量本来就非常非常低。为了方便起见，人们可能会说：“我们再补充一点就行了”，但实际上这样做并不可取，因为体内硒含量过高也会导致硒中毒。在培养皿中研究人为添加过量硒的样本，并不能提供太多有价值的信息。
我们使用了这些硒前体，这些都是你在保健品瓶子上常见的成分。我们在培养基中添加了300纳摩尔的这些同位素标记的硒蛋白前体，例如76富硒甲基硒代半胱氨酸、77富硒硒代蛋氨酸或82亚硒酸钠。
我必须强调，我这里所说的同位素，都是稳定同位素。它们不具有放射性，也不像其他同位素那样具有任何危险性。它们都是完全安全的。
我们在培养基中添加了这些物质，还添加了¹⁵N胸苷。¹⁵N是我们的朋友，它是氮的重同位素。这种氨基酸会选择性地标记DNA。我们希望通过这个双标记实验观察到的是，高氮比和高硒比之间是否存在相关性，反之亦然，或者可能根本没有相关性。
如果我们看一下刚采集到的初始图像，也就是使用之前的工作构建器生成的图像，会发现硒的含量非常低。这可能并不出乎意料，因为硒的含量本来就很低，即使我们进行了这么长时间的计数也是如此。这张图像左侧显示的是硒的比率图像。
这大概花了一天半到两天的时间进行图像采集，主要是收集样品在被主离子束扫描时的计数数据。当我们生成比值图像时，可以看到灰色区域里有很多缺失数据。这里面可能隐藏着很多我们不容易直接观察到的信息。
这张图像里基本上只有两个细胞。这是碳氮图，主要展示的是细胞的生物量。其他部分，也就是它们之间的暗物质，都是包埋树脂。这些样本被包埋在聚合物树脂中，然后用金刚石刀切成非常薄的片。我们看到计数很低。
甚至在我们进一步研究之前，我们就想到：“或许通过图像分箱来牺牲一些空间分辨率，换取更多的计数，效果会更好。” 我现在意识到，我正在把 JMP 变成一款图像分析软件，这原本并非我的初衷。但它拥有如此强大的动态链接功能。两者结合得非常完美。
我现在要把这个窗口拉回去关上。我得感谢 Julian Paris。去年，我们午休的时候讨论过如何整理图片。我简单回顾一下。现在我们已经把这个功能集成到工作流构建器里了。让我把这张图片截下来。
这是原始数据。分箱的诀窍在于两步操作。这里我不会推导同位素比值。但接下来我们要做的是选择 X 列和 Y 列。然后进入“实用工具”选项卡，并创建一个分箱公式。我将选择“分割点”，并将数据分成 4x4 等宽的箱。
我要使用等分箱。偏移量设为零就可以了。把它改成 4，好的，然后全部设为 X 轴，再创建公式列。这样我们就有了两列，分别是 X 轴分箱列和 Y 轴分箱列。我们转到表格，找到汇总表，我还想调整所有计数列，所以我要选中所有这些列。
在“统计”选项卡下，我想对所有内容进行求和。现在我要把所有像素的计数都加到这个 4x4 的单元格中。这部分可能不太明显，因为我们要按 X 轴和 Y 轴分组。好的。现在我们有了分组后的图像，可以把它显示在“图表生成器”中。图表和 X、Y 轴。我们现在先用 CN 值着色，所以……因为它是分组后的，所以我们把标记的大小稍微调大一点。
现在我们又有了四个计数。这里的坐标轴刻度有点复杂。不过，我觉得还是值得展示一下，以防其他人也遇到类似的问题，因为我们刚开始操作的时候，其实并没有那么明显。我先关掉这个窗口，然后回到 PowerPoint。
图像分箱完成后，我们计算了氮同位素比值和硒同位素比值。我们得到了所有元素的分布图和热图。在观察热图时，我们发现了一些异常之处。硒同位素比值似乎与77硒和80硒都呈负相关。分子和分母都呈负相关，这似乎不太合理。按理说应该是77硒和80硒呈负相关，但事实并非如此。
我们开始感到疑惑。我们真正好奇的是硒同位素比值及其分布中出现的这些异常值。我们也注意到氮同位素比值中存在很多异常值。但这并没有让我们太担心，因为我们知道计数率更高。基本上，根据经验，我们知道通过注射¹⁵N胸苷，尤其是在微摩尔浓度下，可以获得这种水平的同位素比值。但对于硒同位素比值，我们并不确定。这完全是未知领域。
于是我们决定：“让我们更仔细地看看这些异常值。”我们进行了稳健拟合异常值检验，发现其中大部分实际上已被稳健拟合算法识别为异常值。
移除这些因素后，我们重新绘制了热图和散点图矩阵，现在情况似乎更合理了。硒含量为 77 的样本与该比率值呈微弱的正相关，而硒含量为 80 的样本则略微呈负相关¹。这样就更符合实际情况了。
当时我们就想，“不如试试做个简单的聚类分析吧。” 我们照做了。我们做了个简单的K均值聚类，只考察了三个变量。非常简单：磷、硒同位素比值和氮同位素比值。
我们希望发现，或者至少根据我们的假设，应该存在一个硒含量高、氮含量高的簇，在这种情况下，硒蛋白确实与 DNA 结合，以帮助保护 DNA 免受某些损伤。
但我们查看平行图，却从未发现这种情况。要么一个值高于另一个值，要么反之亦然，要么两者大致相同，但数值都很低。这是我们第一次意识到，或许我们的模型行不通，或者我们的假设是错误的。
当我们分析这些硒同位素比值的异常值时，发现它们都与极低的80硒含量相关。实际上，它们的77硒含量应该更低一些。事实上，它们基本上都嵌入在基质或包埋树脂中。
这让我们想到：“我们必须更进一步，因为所有这些包埋树脂都会影响我们的分析结果。我们必须去除它们。” 这很容易做到。我们可以再做一次快速的聚类分析，基本上只用拷贝数（CN）和其他几个指标，进行两次聚类。通过高拷贝数（CN）值，我们可以明显地将所有这些树脂分离出来，只留下细胞。我们可以从中创建一个子集表，得到一个新的数据表进行后续分析。
这就得到了散点图矩阵和热图，现在我们来看一下硒同位素比值。我们看到，在 80 处，它是负相关；在 77 处，则是更强的正相关。现在一切都说得通了。但我们真正感兴趣的是硒同位素比值和氮同位素比值，它们现在显示出完全的负相关。这意味着我们之前认为的情况并非如此。要研究其他方面，我们需要观察数百个这样的细胞。
我们现在有了完整的流程构建器，它整合了图像的 4x4 分区，并使用了三次图表构建器来处理三种不同的质量、CN 值、硒同位素比值、氮同位素比值、分布情况、首次多元统计分析、异常值分析、K-均值聚类和平行坐标图。K-均值聚类用于分割细胞。
新的数据表已通过图表构建器创建。我们可以继续进行多元统计分析。至此，我们的工作就完成了。不过，我们还添加了另一个 K-均值聚类图和平行图。
不如就演示一下它的工作原理，因为它挺有意思的。我们依次点击“文件”、“打开最近使用的文件”，这就是这个文件。现在我们要打开“工作流构建器”的最近使用的文件。这是第二部分，就到这里。我们启动它，然后实时观察它的运行情况。
这里依次是第一组图像、第二组、第三组图像、分布图、散点图矩阵和异常值分析。接下来是散点图、K均值聚类和数据子集图像。最后是最后一个散点图矩阵。现在只需直接打开文件即可运行。这样可以节省大量时间。
这样很好，因为我可以开发这些东西，然后发给我的同事，这样她查看数据的时候就不用做这么多操作了。她只需要点击“运行”，所有数据就都显示出来了。好了，我们把所有东西都关掉吧。
最后还有一件事。今天是1月份，但到了3月份……实际上，这是倒数第二件事。是的，我忘了。完成所有这些之后，我们对那部分数据进行了更多的K均值聚类。同样，从平行图中我们可以看到，当我们观察所有不同的聚类时，完全没有发现高硒或高氮的迹象。
我会分别进行三个最小和三个最大十个簇的分析，然后只选择根据CCC标准筛选出的最佳簇。但无论哪种情况，都没有发现硒和氮含量高的簇。
我们的结论是，至少就直接而言，没有证据表明这些硒蛋白仅仅通过空间上的关联就能保护DNA。但它们可能通过某种间接机制发挥保护作用，但这远远超出了我们此次研究的范围。
最后，正如我所说，现在才一月底。希望到三月份，我能就此发表更多看法。但我认为我们可以这样利用函数式数据浏览器来帮助我们进行另一种所需的分析。
我一开始就给你们展示了每个探测器采集到的高分辨率质谱图。我们采集这些谱图是因为在设置探测器时，我们需要知道实际分析的是哪个质量，因为在很多情况下，会存在大量的质量干扰。
刚才我在探测器端的这个区域进行了放大，分离出的离子束穿过一组偏转板，这些偏转板会将聚焦的二次离子束扫描通过一个狭缝，然后进入探测器。这个离子束的直径比狭缝的宽度要窄。你可以看到，当偏转幅度很大时会发生什么。离子束实际上并没有击中探测器；它更多地击中了狭缝的边缘，而不是到达探测器。
偏转路径使粒子偏转得更厉害，粒子开始进入狭缝并向探测器运动，因此计数开始上升。当粒子完全进入狭缝后，计数基本上会形成一个平坦的峰值，然后开始下降。可能还会出现来自另一个粒子的第二个峰值。这就是我们在这里看到的。计数再次下降，最后出现第三个峰值。
在分析过程中，我们会选择想要检测的峰值，并设置偏转电压，使只有该峰值的信号能够通过检测器。如果设置不当，则意味着采集到的所有数据基本上都无效。
对于很多元素，比如¹⁵N和我们经常使用的¹³C，我们都知道它们的谱图是什么样的。但对于硒来说，要确定我们确实探测到的是硒，这确实是一个相当大的挑战，尤其是在计数率如此之低的情况下。
但当我仔细研究这些数据，并开始使用功能数据浏览器（Functional Data Explorer）时，我们讨论小波的应用时，我首先注意到的是，这些频谱看起来几乎与哈尔小波完全相同。此外，由于我们设置了阈值和检测器增益，以确保几乎没有电子背景干扰，并且响应保持一致，因此基本上没有背景噪声。
我们必须这样做，因为我们一直在测量同位素比值，但我们使用的是两个不同的探测器。如果这两个探测器没有进行精确的相互校准，我们测量正确同位素比值的能力就会降低。
基本上，我们只需要知道其中一个峰的位置以及它对应的元素即可。在这个例子中，我知道这个宽峰是¹²C和¹⁴N。而这个峰是¹²C、¹³C和¹H的一部分。这三个峰的元素丰度之和为26。
如果我们知道其中一个是什么，就可以通过质量差推算出另一个是什么。这个标尺并不重要，因为我们始终关注的是质量差。我们可以校准它以使其始终保持精确，但这需要耗费大量的精力和时间。
如果我们知道其中一个峰是什么，我们就可以计算出其他峰是什么，它们之间的差异是多少，然后将其与我们已有的程序关联起来。本质上，我们可以输入我们认为样本中存在的所有元素，程序会输出所有可能的结果，这些结果加起来等于样本的质量，以及与特定峰的差异。
如果我们能利用FDE像反卷积一样把这些干扰都分离出来，这对我们来说将是莫大的福音，尤其是在一些质量较大的星系中，干扰更多，也更难分辨。目前我只能说这么多。不过，等到会议召开的时候，我应该会有更多信息，或许还能举些例子。
但现在，我只想特别感谢几位同事。首先是可持续氮基金会的戴维·登特博士，以及诺丁汉大学的埃里克·默奇教授和泰德·科金教授。他们在GD细菌固氮作用的首个案例研究中发挥了重要作用。其次是哈佛医学院的黛安·汉迪博士和克劳德·勒切内教授。他们对硒蛋白的研究也至关重要。最后，还要感谢我在英国国家物理实验室（NPL）的NiCE-MSI的所有同事。
令人悲痛的是，我想告诉大家，泰德和克劳德已经去世了。这对科学界来说是一个巨大的损失，但我们会通过这次演讲以及未来更多的演讲来缅怀他们。非常感谢大家，如果您有任何问题，我很乐意为您解答。
