2020년 뮌헨에서 열린 불운했던 JMP 서밋은 주최측의 놀라운 상황 전환 능력을 보여주었는데, 당시 우리는 고해상도(나노SIMS) 질량 분석 이미지 분석에 JMP를 적용한 초기 사례를 선보였습니다.
이번 발표에서는 이전 발표 이후 진행된 연구 성과를 업데이트합니다. 동적 연결 및 그래프 빌더를 활용한 가장 기본적인 분석 절차를 간략히 살펴본 후, 클러스터 분석을 포함한 고급 분석으로 넘어가고, 마지막으로 JMP Pro 기능 데이터 탐색기를 활용하여 질량 스펙트럼 해석에 어떻게 도움이 되는지 보여드리겠습니다.
최근 JMP 17에 도입된 워크플로 빌더 덕분에 이러한 분석을 훨씬 더 빠르게 수행할 수 있게 되었습니다. 암 연구(암 종양 조직)부터 박테리아를 이용한 토양 비료의 친환경화에 이르기까지 다양한 사례 데이터 세트를 활용합니다. 각 연구에 대해 간략하게 중요성을 설명한 후, 최종 결과에 도달하기까지의 단계를 직접 시연합니다.
안녕하세요, 여러분. 저는 영국 테딩턴에 있는 국립물리연구소(NPL)의 수석 과학자인 그렉 맥마흔입니다. 오늘 저는 고해상도 질량 분석 이미지 분석에 JMP와 JMP Pro를 활용하는 데 있어 최근 이루어진 발전에 대해 이야기하고자 합니다.
이번 발표는 약 4년 전 뮌헨에서 열릴 예정이었던 회의에서 제가 발표했던 내용을 이어가는 것입니다. 당시 코로나19 팬데믹으로 인해 회의가 온라인 회의로 급히 전환되었지만, 그 당시 참석자분들이 발 빠르게 적응하여 온라인 회의를 성공적으로 이끌어낸 것은 정말 놀라운 일입니다. 오늘 이렇게 여러분과 직접, 그리고 온라인으로 함께하게 되어 기쁘고, 발표도 하고 이번 주 내내 여러분과 이야기를 나눌 수 있기를 기대합니다.
먼저, 높은 공간 해상도의 질량 분석 이미징을 얻는 수단인 나노SIMS에 대해 설명드리겠습니다. 왼쪽에 장비 사진이 있습니다. 전 세계적으로 약 55대 정도밖에 없는 장비입니다. 다양한 분야에 사용되는데, 저희 연구소에서는 생물학 분야에 80% 정도, 물리 과학, 금속 공학, 재료 과학, 반도체 분야에 20% 정도 사용하고 있습니다.
간단히 말해서, 이 장비는 어떻게 작동할까요? 이온 빔을 생성하고 가속하여 관심 있는 시료 쪽으로 집중시킵니다. 이 이온 빔이 시료에 부딪히면, 시료에 전달되는 에너지로 인해 시료 표면의 원자와 분자가 떨어져 나갑니다. 이 과정에서 떨어져 나온 물질 중 아주 작은 일부가 이온화됩니다.
강한 정전기장을 가해 이온화시키고 전하를 띠게 한 다음, 이 이온들을 모아서 2차 컬럼이라고 하는 곳에 집중시킨 후 자석으로 보낼 수 있습니다. 우리는 자기장 질량 분석기를 사용합니다. 이 분석기는 프리즘이 빛을 여러 파장으로 분리하는 것과 매우 유사한 방식으로 이온들을 질량 대 전하 비율에 따라 분리합니다.
분리가 완료되면, 7개의 검출기가 있는 다중 수집 챔버가 나타납니다. 이 검출기 중 6개는 전동 트롤리에 장착되어 있어 원하는 위치로 이동할 수 있습니다. 나머지 1개는 자석의 가장 높은 반경에 고정되어 있습니다. 일반적으로 질량이 가장 큰 입자가 이 고정된 검출기에 배치되고, 나머지 6개는 그에 맞춰 위치가 조정됩니다.
각 검출기 앞에서 우리는 소위 높은 질량 분해능을 갖는 질량 스펙트럼을 얻을 수 있는데, 이것이 바로 여기에 보이는 것입니다. 이 스펙트럼에는 일반적으로 질량 간섭을 나타내는 여러 개의 피크가 포함되어 있습니다. 이 부분에 대해서는 발표 후반부에 좀 더 자세히 설명하겠습니다. 하지만 이 방법의 주요 장점은 슬라이드 하단에 요약되어 있습니다. 바로 매우 높은 공간 분해능을 얻을 수 있다는 것입니다. 약 35나노미터까지 분해능을 낮출 수 있으며, 100나노미터는 상당히 일반적인 수준으로, 달성하는 데 큰 노력이 필요하지 않습니다.
또한, 질량 분해능이 매우 높아서 m/delta m 값이 약 15,000~20,000에 달합니다. 이를 통해 여기 질량 스펙트럼에서 볼 수 있는 것과 같은 피크들을 분리할 수 있습니다. 이 기술은 질량 분석법 또는 SIMS(이차 이온 질량 분석법)라고 하며, PPM 및 PPB 수준까지 매우 높은 감도를 제공합니다.
오늘은 저희가 어떻게 발전을 이루어냈는지 몇 가지 사례 연구를 통해 알려드리겠습니다. 지난번에는 암 연구에 어떻게 적용했는지에 대해 이야기했지만, 오늘은 그 이야기는 하지 않겠습니다. 첫 번째 사례는 워크플로 빌더를 저희 워크플로에 어떻게 통합했는지에 대한 아주 간단한 예시입니다. 이 도구는 정말이지 거의 구세주와 같은 존재입니다.
첫 번째 사례 연구는 식물 성장을 돕기 위해 사용하는 질소 비료와 기후 변화에 미치는 영향에 관한 것입니다. 전 세계적으로 농업 생산량을 제한하는 가장 중요한 요소는 고정 질소의 가용성입니다. 불행히도, 합성 질소 비료는 생산 과정에서 암모니아와 아산화질소를 배출하여 대기 오염을 유발합니다. 또한 스모그를 발생시키고 특정 오염 물질을 배출하기도 합니다. 이러한 비료가 농작물에 사용되면 생태계 산성화와 수질 질산화를 초래하는 등 기후 변화에 악영향을 미칩니다.
불과 30~40년 전쯤에 발견된 놀라운 능력은 특정 박테리아가 대기 중의 불활성 질소(N₂)를 흡수하여 암모니아로 고정시킬 수 있다는 것입니다. 이렇게 고정된 암모니아는 식물이 아미노산, 엽록소, 단백질 합성에 사용할 수 있도록 방출됩니다. 사실상, 앞서 언급했던 유해한 합성 질소 비료를 대체할 수 있는 것입니다.
하지만 지금까지 식물에서 이러한 현상을 미시적 또는 나노 규모로 실제로 보여준 사람은 아무도 없었습니다. 대규모 분석에서는 이러한 현상이 나타났지만, 우리는 훨씬 더 높은 공간 해상도로 이를 더 자세히 살펴보고 싶었습니다.
이번 실험에서는 질소 동위원소 ¹⁵N₂가 15N₂인 환경에서 자란 옥수수 잎을 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 다른 합성 비료는 전혀 사용하지 않았습니다. 따라서 ¹⁵N₂의 다른 공급원은 없습니다. 잠시 설명을 덧붙이자면, ¹⁵N₂는 질소의 무거운 동위원소입니다. 자연적인 비율은 약 0.0037%입니다. 우리는 0.0037%의 ¹⁵N₂ 대신 거의 100%에 가까운 ¹⁵N₂ 환경에서 옥수수를 재배하고 있습니다. 질량 분석기를 사용하여 식물에서 ¹⁵N₂를 검출할 계획입니다.
이 시점에서 1차 분석이 무엇이며, JMP 워크플로 빌더를 어떻게 활용하여 그 결과를 얻었는지 간략하게 설명드리겠습니다. 저희의 원시 데이터 파일은 사실 매우 간단합니다. 픽셀 위치를 정의하는 두 개의 열과, 측정된 다양한 질량의 개수를 담고 있는 7개 정도의 열로 구성된 CSV 파일입니다.
일반적으로 동위원소 비율을 살펴볼 때 가장 먼저 하는 일은 비율을 구성하는 두 질량을 가져와 동위원소 비율 값에 대한 새 열을 추가하는 것입니다. 그래프 빌더를 사용하면 여기에서 볼 수 있는 이온 이미지를 재구성할 수 있습니다. 이 이미지는 식물 단면의 탄소와 질소 이온 이미지입니다. 다양한 세포 소기관이 보입니다. 이것은 식물 핵이고, 이것들은 엽록체입니다.
이 이미지는 질소 동위원소 비율 이미지로, 색상 스케일이 있습니다. 가장 진한 파란색은 자연적인 비율, 즉 일반 질소에서 나타나는 비율을 나타냅니다. 그 위쪽은 모두 ¹⁵N 비율이 높은 것으로, 이 경우 식물이 재배된 환경의 ¹⁵N₂ 가스에서만 유래했을 가능성이 있습니다.
이제 우리는 박테리아가 접종된 종자가 질소를 고정하고 식물 전체에 퍼뜨리는 역할을 제대로 수행했다는 증거를 확보했습니다. 또한 다양한 측정값의 분포, 특히 이상치가 어디에 있는지 살펴보는 것도 매우 유용합니다.
제가 예전에 하던 방식대로, 그러니까 모든 단계를 수동으로 진행하면서 시간을 재봤습니다. 화면에 보이는 단계까지 도달하는 데 약 3분이 걸렸습니다. 하지만 워크플로 빌더를 사용하면 이제 약 5초밖에 걸리지 않습니다. 하루에 이런 파일을 20개 정도 처리한다고 가정하면, 하루에 최대 45분에서 1시간까지 시간을 절약할 수 있습니다. 한 달, 그리고 1년 동안 쌓이면 상당한 시간 절약 효과를 볼 수 있습니다.
이게 어떻게 보이는지 간단하게 보여드리겠습니다. 최근 파일을 열어보시죠. 이 파일을 선택하겠습니다. 말씀드린 대로, 이게 원본 파일입니다. X, Y 두 열이 있는데, 각각 픽셀 위치와 각 덩어리의 개수를 나타냅니다.
이제 파일, 최근 열기, 파트 1, 워크플로 빌더로 이동하겠습니다. 워크플로 빌더가 보이네요. 크기를 조금 줄여보죠. 단계별로 실행해 보겠습니다. 새 열이 삽입되고, '질소 동위원소 비율'이라는 제목이 지정됩니다. 비율이 계산되는 수식이 입력됩니다. 이것이 바로 원본 CN 이미지입니다. 제가 처음 보여드렸던 이미지인데, 슬라이드에서는 컬러로 표시되었지만 실제로는 흑백 이미지였습니다.
여기 질소 동위원소 비율 이미지가 있습니다. 분포를 살펴본 후 산점도 행렬과 히트맵을 이용한 간단한 다변량 통계 분석을 통해 마무리할 수 있습니다. 특정 세포 소기관에서 비율이 더 높게 나타난 것을 확인할 수 있습니다. 이 소기관들은 엽록체라고 하며, 광합성을 담당하는 세포 소기관입니다.
질소가 엽록체에 우선적으로 공급되는 것은 거의 이중적인 이득입니다. 질소가 엽록체의 성장과 기능을 지원하는 데 우선적으로 사용되기 때문입니다. 엽록체는 대기 중의 이산화탄소를 흡수하여 식물 성장에 필요한 에너지로 전환하는 세포 소기관입니다. 기후 변화 관점에서 보면 이는 실제로 윈윈 전략입니다. 토양에 합성 질소를 사용할 필요성을 줄이는 동시에 대기 중의 이산화탄소를 흡수하는 데에도 도움을 줄 수 있습니다.
하지만 이왕 얘기 나온 김에 한 가지 더 말씀드리겠습니다. 흥미로운 점은 황 신호에서 나타난 높은 이상치들입니다. 이 이상치들을 선택해 보겠습니다. 보시다시피 선택된 부분들은 분홍색으로 표시되어 있습니다. 이 이상치들은 주로 엽록체에서만 나타나는데, 엽록체에 따라 나타나는 빈도가 다릅니다. 그 이유는 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, 시간적인 영향일 가능성이 있습니다.
하지만 이는 중요한 사실인데, 질소 고정 반응이 일어나려면 황이 풍부한 효소의 도움이 필요하기 때문입니다. 이는 이번 시료 분석에서 얻은 추가적인 이점이었습니다.
워크플로 빌더를 사용한 간단한 1차 분석입니다. 시간을 엄청나게 절약해 주죠. 이제 모든 것을 마무리하고 파워포인트로 돌아가서 다음 슬라이드로 넘어가겠습니다. 이 슬라이드는 방금 보여드린 것처럼 황이 엽록체로 우선적으로 이동하여 질소 고정 반응을 돕는 부분입니다.
사실 그건 꽤 간단한 분석이었지만, 때로는 훨씬 더 복잡한 분석이 필요한 경우도 있습니다. 두 번째 예시는 셀레노단백질이라고 불리는 물질에 대한 연구입니다. 건강식품점에 가보시면 셀레늄 보충제 코너를 보신 적이 있을 겁니다.
셀레노단백질은 아직 초기 단계에 있기 때문에 매우 흥미로운 분야입니다. 많은 것이 알려져 있지만, 셀레노단백질이 인체에서 어떻게 작용하는지에 대해서는 아직 알려지지 않은 부분이 많습니다. 셀레노단백질이 뇌를 보호하고 면역 체계를 강화하는 데 효과적이라는 주장과 이를 뒷받침하는 증거들이 있습니다. 또한 항산화 작용을 하고, 생식 기능을 돕고, 갑상선 기능을 지원하며, 항돌연변이 효과를 통해 DNA 손상을 예방하는 데 도움을 줄 수 있다는 연구 결과도 있습니다.
이 연구에서 우리가 구체적으로 다루고자 했던 질문은 셀레노단백질이 실제로 DNA와 결합하여 DNA의 무결성을 보호하는 데 도움이 되는가 하는 것이었습니다. 우리가 사용한 기술은 공간 해상도가 매우 높은 질량 분석 이미징으로, 이러한 분석을 수행하고 상당히 효과적으로 결과를 도출할 수 있는 몇 안 되는 기술 중 하나입니다.
셀레노단백질의 문제는 우리 몸에 이미 매우 적은 양으로 존재한다는 것입니다. 편의상 "조금 더 첨가하면 되지 않을까?"라고 생각할 수도 있지만, 실제로는 그렇게 해서는 안 됩니다. 체내에 셀레늄이 과다하게 축적되면 셀레늄 중독을 일으킬 수 있기 때문입니다. 인위적으로 셀레늄을 과다하게 첨가한 배양 접시 샘플을 연구하는 것은 그다지 유익한 결과를 가져오지 못합니다.
우리는 셀레늄 전구체를 사용했는데, 이는 일반적으로 건강 보조 식품 병에서 찾아볼 수 있는 성분들입니다. 우리는 셀레노단백질용 동위원소 표지 전구체인 76셀레늄 강화 메틸셀레노시스테인, 77셀레늄 강화 셀레노메티오닌 또는 82셀렌산나트륨을 300나노몰 농도로 첨가한 배양 배지를 사용했습니다.
여기서 동위원소라고 말할 때, 모두 안정 동위원소라는 점을 강조하고 싶습니다. 방사성 동위원소도 아니고, 완전히 안전한 동위원소들입니다.
우리는 배양 배지에 이것들을 첨가했을 뿐만 아니라, ¹⁵N 티미딘도 첨가했습니다. ¹⁵N은 질소의 무거운 동위원소로, 우리에게 중요한 역할을 합니다. 이 아미노산은 DNA를 선택적으로 표지합니다. 이중 표지 실험을 통해 우리는 질소 비율이 높은 부분과 셀레늄 비율이 높은 부분 사이에 상관관계가 있는지, 또는 그 반대의 경우인지, 아니면 아무런 상관관계가 없는지 확인하고자 합니다.
초기 이미지를 살펴보면, 이전에 사용했던 워크 빌더를 사용했을 때의 결과입니다. 셀레늄 수치가 매우 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있습니다. 셀레늄은 함량이 매우 낮기 때문에, 오랜 시간 동안 측정했음에도 불구하고 이러한 결과는 그다지 놀라운 일이 아닙니다. 왼쪽 이미지는 셀레늄 비율 이미지입니다.
이 이미지 획득 작업은 아마도 하루 반에서 이틀 정도 걸렸을 겁니다. 1차 이온 빔이 시료를 스캔하면서 계수값을 수집하는 데만 시간이 걸렸죠. 비율 이미지를 만들면 회색 영역이 보이는데, 이 부분에 누락된 데이터와 회색 영역들이 많이 있습니다. 아마 눈에 잘 띄지 않는 데이터도 엄청나게 많을 겁니다.
이 이미지에는 기본적으로 두 개의 세포가 있습니다. 이것은 탄소와 질소를 합한 이미지로, 세포의 생체량을 보여줍니다. 그 외의 모든 것, 즉 세포 사이에 있는 암흑 물질은 고정용 수지입니다. 이 샘플들은 고분자 수지에 고정된 후 다이아몬드 칼날로 매우 얇게 절단됩니다. 보시다시피 방사능 수치가 낮습니다.
더 진행하기 전에, "이미지를 비닝해서 공간 해상도를 희생하더라도 더 많은 카운트를 얻는 게 나을지도 몰라"라고 생각했습니다. 이제 보니 제가 JMP를 이미지 분석 소프트웨어처럼 쓰고 있는 것 같은데, 원래 의도는 전혀 그렇지 않았습니다. 하지만 동적 링크 기능 덕분에 두 프로그램의 조합은 정말 훌륭합니다.
이제 다시 창을 닫겠습니다. 줄리안 파리스에게 감사를 표해야겠네요. 작년에 점심시간에 이미지 분류 방법에 대해 이야기를 나눴었는데요. 간단히 설명드리자면, 이제 이 기능이 워크플로우 빌더에 통합되었습니다. 이 이미지를 가져오겠습니다.
이것이 원본 데이터입니다. 이 데이터를 구간별로 나누는 요령은 두 단계 과정입니다. 여기서는 동위원소 비율을 계산하지는 않겠습니다. 먼저 X열과 Y열을 선택합니다. 그런 다음 '유틸리티'로 이동하여 구간 나누기 공식을 만듭니다. '분할점'에서 4x4의 동일한 구간 너비로 나누겠습니다.
저는 등간격으로 설정할 거예요. 오프셋은 0으로 해도 괜찮아요. 값을 4로 바꾸고, 확인을 누른 다음 모든 열을 X로 만들고 수식 열을 만들겠습니다. 그러면 X 구간 열과 Y 구간 열, 이렇게 두 개의 열이 더 생겼어요. 이제 표로 이동해서 요약 표를 만들고, 모든 개수 열도 함께 나누고 싶으니 모두 선택하겠습니다.
통계 탭에서 모든 값을 합산하고 싶습니다. 이제 개별 픽셀의 카운트를 4x4 크기의 하나의 구간으로 합산하겠습니다. 이 부분이 조금 헷갈릴 수 있었는데, X축과 Y축을 기준으로 그룹화하는 것입니다. 좋습니다. 이제 구간별로 나뉜 이미지가 생성되었으니 그래프 빌더에 표시해 보겠습니다. 그래프에서 X, Y 값을 선택하고, 일단 CN 값으로 색칠해 보겠습니다. 구간별로 나뉘었으니 마커 크기를 조금 더 크게 해 보겠습니다.
이제 네 개의 항목이 더 추가되었습니다. 축 눈금 때문에 조금 복잡해 보이긴 하지만, 혹시 다른 분들도 이미지 작업을 하실 때 참고하시라고 보여드리는 게 좋을 것 같았습니다. 처음 작업할 때는 이 부분이 그렇게 명확하게 드러나지 않았거든요. 이제 창을 닫고 파워포인트로 돌아가겠습니다.
이미지를 그룹별로 분류한 후, 질소 동위원소 비율과 셀레늄 동위원소 비율을 계산했습니다. 모든 분포와 히트맵을 얻었는데, 히트맵을 살펴보니 뭔가 좀 이상한 점이 있었습니다. 셀레늄 동위원소 비율이 77 셀레늄과 80 셀레늄 모두와 음의 상관관계를 보이는 것 같았습니다. 분자와 분모 모두와 음의 상관관계가 있다는 건 뭔가 잘못된 것 같았습니다. 보통은 한쪽만 음의 상관관계를 보여야 할 텐데 말이죠.
우리는 의문을 품기 시작했습니다. 특히 셀레늄 동위원소 비율과 그 분포에서 나타나는 이상치들이 궁금했습니다. 질소 동위원소 비율에서도 비슷한 이상치들이 많이 발견되지만, 이는 계수율이 높다는 것을 알고 있기 때문에 크게 문제가 되지는 않습니다. 경험적으로 ¹⁵N 티미딘을 투여하면, 특히 마이크로몰 농도에서 그 정도의 동위원소 비율을 얻을 수 있다는 것을 알고 있습니다. 하지만 셀레늄 동위원소 비율의 경우는 확신할 수 없었습니다. 미지의 영역인 셈입니다.
그래서 우리는 "이러한 이상치들을 좀 더 자세히 살펴보자"라고 결정했습니다. 강건한 적합 알고리즘을 이용한 이상치 검사를 실시한 결과, 대부분의 이상치가 실제로 강건한 적합 알고리즘을 통해 이상치로 식별되었다는 것을 알게 되었습니다.
그 요소들을 제거하고 히트맵과 산점도 행렬을 다시 만들니 이제 좀 더 이해가 되는 것 같습니다. 셀레늄 77은 비율 값에서 아주 약한 양의 상관관계를 보였고, 80은 약간 음의 상관관계를 보였습니다. 이렇게 하니 훨씬 더 타당해 보입니다.
그 시점에서 우리는 "간단한 군집 분석을 해보자"라고 생각했습니다. 그래서 그렇게 했습니다. 세 가지 변수만 고려한 간단한 K-평균 군집 분석을 수행했습니다. 아주 간단한 분석이었죠. 인, 셀레늄 동위원소 비율, 그리고 질소 동위원소 비율입니다.
우리가 찾고자 하는 것, 또는 적어도 우리의 가설에 따르면, 셀레노단백질이 실제로 DNA와 결합하여 DNA 손상으로부터 DNA를 보호하는 데 도움을 주는 경우, 셀레늄과 질소 함량이 모두 높은 클러스터가 존재해야 합니다.
하지만 평행 그래프를 살펴보면 그런 현상은 전혀 나타나지 않습니다. 항상 한쪽이 다른 쪽보다 높거나 그 반대이거나, 아니면 대략 비슷하지만 낮은 수준입니다. 이것이 바로 우리의 가설이 틀렸거나 제대로 작동하지 않는다는 첫 번째 신호였습니다.
셀레늄 동위원소 비율의 이상치를 살펴보니, 모두 극히 낮은 80셀레늄 수치와 관련이 있었습니다. 실제로는 77셀레늄이어야 합니다. 사실, 이 이상치들은 모두 매트릭스 또는 포매 수지에 기본적으로 포함되어 있었습니다.
이것을 계기로 우리는 "이 모든 고정 레진이 분석에 편향을 일으키고 있으니 한 단계 더 나아가야겠다. 이걸 제거해야 해."라고 생각하게 되었습니다. 이건 간단하게 해결할 수 있습니다. CN 값과 몇 가지 다른 변수들을 사용하여 간단한 클러스터 분석을 다시 수행하면 됩니다. 두 개의 클러스터를 생성하고, 높은 CN 값을 통해 이 부분을 명확하게 구분할 수 있습니다. 남은 세포들만 남겨두고 나머지 부분을 분리한 후, 해당 데이터 테이블에서 일부를 추출하여 새로운 데이터 테이블을 만들 수 있습니다.
이것이 바로 우리가 산점도 행렬과 히트맵을 얻게 된 이유입니다. 이제 셀레늄 동위원소 비율을 살펴보겠습니다. 80에서는 음의 상관관계가 나타나고, 77에서는 훨씬 강한 양의 상관관계가 나타납니다. 이제 모든 것이 이해가 됩니다. 하지만 우리가 정말 관심 있는 것은 셀레늄 동위원소 비율과 질소 동위원소 비율인데, 이 둘은 이제 완전한 음의 상관관계를 보여줍니다. 즉, 우리가 생각했던 것과는 다른 결과가 나타났다는 뜻입니다. 다른 영역을 살펴보려면 이러한 셀을 수백 개 살펴봐야 합니다.
이제 저희는 이미지를 4x4 빈으로 나누고, 세 가지 질량에 대해 그래프 빌더를 세 번 사용하여 CN, 셀레늄 동위원소 비율, 질소 동위원소 비율, 분포, 다변량 통계(1차 실행), 이상치 분석, K-평균 클러스터링 및 평행 좌표 플롯을 통합한 완벽한 워크플로 빌더를 갖추게 되었습니다. K-평균 클러스터링은 세포를 분할하는 데 사용됩니다.
새로운 데이터 테이블이 그래프 빌더에 생성되었습니다. 이제 다변량 통계 분석을 진행할 수 있습니다. 여기서 마무리되지만, K-평균 클러스터링과 병렬 플롯도 추가했습니다.
이게 어떻게 작동하는지 보여드리는 게 좋겠네요. 꽤 재밌거든요. 파일 메뉴에서 '최근에 열기'를 선택하면 이 파일이 나옵니다. 이제 워크플로 빌더를 사용해서 '최근에 열기'를 선택해 볼게요. 이게 두 번째 단계입니다. 실행해서 실시간으로 어떻게 작동하는지 지켜보죠.
첫 번째 이미지 세트, 두 번째 세트, 세 번째 세트, 분포, 산점도 행렬, 이상치 분석이 차례로 나옵니다. 다음으로 산점도, K-평균 클러스터링, 데이터 부분집합 이미지가 표시됩니다. 마지막으로 최종 산점도 행렬이 나옵니다. 이제 파일을 열기만 하면 바로 실행할 수 있습니다. 이렇게 하면 시간을 엄청나게 절약할 수 있습니다.
이게 좋은 점은 제가 이런 것들을 개발해서 동료에게 보내면, 동료가 데이터를 볼 때 제가 직접 할 필요 없이 그냥 '시작' 버튼만 누르면 모든 게 바로 보이니까요. 자, 이제 다 닫고 마무리하죠.
마지막으로 한 가지만 더 말씀드리겠습니다. 오늘은 1월이지만 3월이 되면… 아, 사실 이건 마지막에서 두 번째입니다. 네, 깜빡했네요. 이 모든 작업을 마친 후, 해당 데이터 하위 집합으로 K-평균 클러스터링을 추가로 수행했습니다. 다시 한번, 병렬 그래프에서 볼 수 있듯이 모든 클러스터를 살펴보았을 때 셀레늄과 질소 수치가 높은 경우는 전혀 나타나지 않습니다.
최소 10개, 최대 10개씩 클러스터를 세 개 만들고, CCC 기준에 따라 가장 좋다고 나온 클러스터 하나만 사용하겠습니다. 하지만 어떤 경우에도 셀레늄이나 질소 함량이 높은 징후는 발견되지 않았습니다.
결론적으로, 적어도 직접적으로는 셀레노단백질이 단순히 공간적 결합을 통해 DNA를 보호한다는 증거는 없다는 것입니다. 하지만 간접적인 메커니즘이 작용할 가능성은 여전히 있지만, 이는 본 연구의 범위를 훨씬 벗어나는 내용입니다.
마지막으로, 말씀드렸듯이 아직 1월 말입니다. 3월쯤에는 이 주제에 대해 더 자세히 말씀드릴 수 있을 것 같습니다. 하지만 제가 생각하기에 Functional Data Explorer를 활용해서 필요한 다른 유형의 분석을 진행할 수 있는 방법은 바로 이것입니다.
제가 처음에 보여드린 것처럼 각 검출기에서 얻은 고해상도 질량 분해능 스펙트럼을 얻는 것입니다. 검출기를 설정할 때 실제로 어떤 질량을 분석하는지 알아야 하기 때문에 이러한 스펙트럼을 얻습니다. 많은 경우 질량 간섭이 발생하기 때문입니다.
무슨 일이 일어나냐면, 제가 방금 검출기 쪽 이 영역을 확대해서 보여드렸듯이, 분리된 이온 빔이 편향판들을 통과하면서 좁은 슬릿을 통해 초점이 맞춰진 이차 이온 빔을 스캔하여 검출기로 보내게 됩니다. 이 빔의 직경은 슬릿의 폭보다 좁습니다. 편향이 상당히 클 때 어떤 일이 일어나는지 보실 수 있습니다. 빔이 검출기에 정확히 도달하지 않고 슬릿 가장자리에 부딪히는 것을 볼 수 있습니다.
굴절 경로가 더 휘어지면서 입자는 슬릿 안으로 들어가 검출기로 향하게 되고, 그 결과 계수값이 증가하기 시작합니다. 어느 시점에 이르면 입자가 슬릿 안에 완전히 들어가게 되고, 그 후에는 평탄한 피크가 나타나기 시작하며, 이후 감소합니다. 다른 질량에서 발생하는 두 번째 피크가 나타날 수도 있습니다. 이것이 바로 우리가 여기서 보는 현상입니다. 계수값은 다시 감소하다가 마지막으로 세 번째 피크가 나타납니다.
분석 과정에서 우리는 원하는 피크를 선택하고, 그 피크 또는 특정 피크만 검출기를 통과하도록 편향 전압을 설정합니다. 만약 이 설정이 잘못되면, 수집된 모든 데이터는 사실상 쓸모없게 됩니다.
¹⁵N이나 ¹³C처럼 우리가 많이 사용하는 원소들의 스펙트럼은 대부분 알고 있지만, 셀레늄의 경우에는 특히 계수율이 너무 낮아서 실제로 셀레늄을 측정하고 있는지 확인하는 것이 정말 어려웠습니다.
하지만 제가 이 데이터를 살펴보고 Functional Data Explorer를 사용해 보니, 웨이블릿 사용에 대해 논의할 때 가장 먼저 눈에 띈 것은 이 스펙트럼들이 Haar 웨이블릿과 거의 똑같다는 점이었습니다. 또 하나는, 검출기의 임계값과 게인을 설정하여 전자적 배경 잡음이 거의 없고 응답이 동일하도록 했기 때문에 배경 잡음이 거의 없다는 것입니다.
이렇게 해야 하는 이유는 우리가 항상 동위원소 비율을 측정해 왔지만, 서로 다른 두 개의 검출기를 사용하고 있었기 때문입니다. 만약 두 검출기가 서로 정확하게 보정되지 않으면, 적절한 동위원소 비율로 측정하는 능력이 저하됩니다.
기본적으로 우리가 알아야 할 것은 이들 중 하나의 위치와 그것이 무엇에 해당하는지입니다. 이 경우, 저는 이 넓은 피크가 ¹²C와 ¹⁴N임을 알고 있습니다. 이것은 ¹²C, ¹³C, ¹H의 일부입니다. 이 둘의 합은 모두 26입니다.
한쪽의 질량을 알면 질량 차이만으로 다른 쪽의 질량을 알아낼 수 있습니다. 질량 차이를 기준으로 측정하기 때문에 척도는 중요하지 않습니다. 물론 이 척도를 항상 정확하게 보정할 수도 있지만, 그러려면 엄청난 노력과 시간이 필요합니다.
하나의 피크가 무엇인지 알면 다른 피크들의 차이점을 계산하고, 이를 기존 프로그램에 입력하여 분석할 수 있습니다. 기본적으로 샘플에 포함되어 있다고 생각되는 모든 원소를 입력하면, 프로그램은 해당 질량의 합과 특정 피크와의 차이를 포함한 모든 가능한 결과를 계산해냅니다.
FDE를 사용해서 마치 디컨볼루션처럼 이 모든 간섭들을 분리해낼 수 있다면, 특히 질량이 큰 입자들처럼 간섭이 많고 분리하기 어려운 영역에서 엄청난 도움이 될 겁니다. 지금으로서는 이 정도밖에 말씀드릴 게 없네요. 하지만 학회가 열릴 때쯤에는 더 자세한 내용과 예시를 제시할 수 있을 것 같습니다.
우선 지금은 몇몇 동료분들께 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 지속가능질소재단의 데이비드 덴트 박사님, 노팅엄 대학교의 에릭 머치 교수님, 테드 코킹 교수님께 감사드립니다. 이분들은 GD 박테리아의 질소 고정에 관한 첫 번째 사례 연구에 중요한 역할을 해주셨습니다. 하버드 의과대학의 다이앤 핸디 박사님과 클로드 레첸 교수님께도 감사드립니다. 이분들은 셀레노단백질 연구에 필수적인 분들이셨습니다. 그리고 NPL의 NiCE-MSI에 있는 모든 동료들에게도 감사드립니다.
슬픈 소식을 전해드리자면, 테드와 클로드 두 분 모두 세상을 떠나셨습니다. 이는 과학계에 큰 손실이지만, 이 강연과 앞으로 있을 많은 강연을 통해 두 분을 영원히 기억하겠습니다. 진심으로 감사드리며, 질문이 있으시면 언제든지 말씀해 주십시오.
