ミュンヘンで開催された不運な2020年サミットでは、JMPサミット主催者の驚くべき機転の能力が示され、高空間分解能（NanoSIMS）質量分析画像の分析に対するJMPの最初のアプリケーションを紹介しました。
この講演では、その発表以降の私たちの進歩について最新情報をお伝えします。ダイナミックリンクとグラフビルダーを活用した最も基本的な分析手順を簡単に確認した後、クラスター分析を特徴とするより高度な分析へと進み、最後にJMP Pro 機能データエクスプローラの応用例を紹介し、質量スペクトルの解釈にどのように役立つかを説明します。
JMP 17に最近導入されたワークフロービルダーのおかげで、これらの分析の多くをはるかに迅速に実行できるようになりました。がん研究（がん腫瘍組織）からバクテリアを用いた土壌肥料の緑化まで、様々なサンプルデータセットを使用しています。それぞれの研究について、その重要性について簡単な背景説明を行い、講演の大部分は、最終結果に至るまでのステップのライブデモンストレーションで構成されています。
皆さん、おはようございます。グレッグ・マクマホンです。英国テディントンにある国立物理学研究所の主任研究員を務めています。本日は、高空間分解能質量分析画像の解析におけるJMPとJMP Proの活用の進歩についてお話させていただきます。
この講演は、約4年前のミュンヘンでの不運な会議で発表したものを引き継いだものです。COVID-19の影響で、急遽オンライン会議に変更されました。しかし、オンライン会議を大成功に導いた皆さんの力は、今でも本当に素晴らしいものです。今日、皆様と直接、そしてオンラインでお会いできることを嬉しく思います。今週を通して、講演を行い、皆様と語り合えることを楽しみにしています。
まず、高空間分解能質量分析イメージングを実現する手段としてのNanoSIMSについてお話しします。左側に装置の画像があります。NanoSIMSは世界に約55台しかなく、様々な用途に使用されています。当社の用途は、生物学が約80%、物理科学、冶金学、材料科学、半導体などが約20%程度です。
簡単に説明すると、この装置はどのように動作するのでしょうか？イオンビームを生成し、加速して対象サンプルに集束させます。このイオンビームがサンプルに衝突すると、サンプルに与えられたエネルギーによって、サンプル中の原子や分子がサンプル表面から弾き出されます。この過程で、弾き出された種のうちごく一部が実際にイオン化されます。
強力な静電場をかけてイオン化し、電荷を帯びたら、集めて二次カラムと呼ばれる部分に集束させ、磁石に送り込みます。ここでは磁場型質量分析計を使用します。この分析計は、プリズムが光を様々な波長に分離するのと非常によく似た方法で、イオンを質量電荷比に応じて分離します。
分離が完了すると、マルチコレクションチャンバーと呼ばれる7つの検出器が設置されます。これらの検出器のうち6つは電動台車に搭載されており、任意の位置に移動できます。7番目の検出器は磁石の半径の最も高い位置に固定されています。通常、最も質量の大きい検出器をこの固定検出器に取り付け、残りの6つの検出器はそれに応じて配置されます。
各検出器の前で、ここに表示されている高質量分解能質量スペクトルを取得できます。このスペクトルには通常、質量干渉と呼ばれる複数のピークが含まれます。これについては、講演の最後にもう少し詳しく説明します。この方法の主な利点は、スライドの下部に記載されています。非常に高い空間分解能が得られます。35ナノメートル程度まで下げることができます。100ナノメートルはごく一般的な値で、達成するのにそれほど手間はかかりません。
また、高い質量分解能（m/Δm）も得られます。これは、質量スペクトルに見られるようなピークを分離することを可能にします。これは質量分析法、またはSIMS法（二次イオン質量分析法）であるため、PPMやPPBレベルまで非常に高い感度が得られます。
今日は、私たちがどのように前進してきたかについて、いくつかのケーススタディについてお話ししたいと思います。前回は、がん研究への適用方法についてお話ししました。今日はその話はしません。まずは、ワークフロービルダーをワークフローに導入した、とてもシンプルな例をご紹介します。これはまさに天の恵みと言えるでしょう。
最初にお話しするケーススタディは、植物の成長を助けるために使用する窒素肥料と、それが気候変動に与える影響についてです。世界中で、農業生産を制限しているのは、固定窒素の利用可能性です。残念ながら、これらの合成窒素肥料は、製造時にアンモニアや亜酸化窒素による大気汚染を引き起こす可能性があります。また、スモッグの発生や、製造過程における特定の汚染も引き起こします。一度使用すると、生態系の酸性化や水路の硝化を引き起こし、気候変動に悪影響を及ぼします。
それほど昔のことではない、おそらく30～40年前に発見されたのは、ある種のバクテリアが大気中の不活性窒素（N₂）を吸収し、それを固定してアンモニアに変換する驚くべき能力を持っているということです。そして、このアンモニアは植物に放出され、アミノ酸、クロロフィル、タンパク質の合成に利用されます。つまり、このバクテリアは、先ほどお話ししたような厄介な合成窒素肥料の代わりとなる可能性があるのです。
しかし、植物において、これを非常にミクロからナノスケールで実際に示した人は誰もいません。これを示すバルク分析はこれまで数多く行われてきましたが、私たちはこれをより詳細に、より高い空間解像度で観察したいと考えました。
このデモンストレーションでは、トウモロコシを窒素15%の大気中で栽培し、他の合成肥料は与えていない植物から葉を採取する方法を紹介します。¹⁵N₂の他の供給源は考えられません。少し話を戻しましょう。¹⁵Nは窒素の重同位体です。自然界での¹⁵N₂の割合は約0.0037%です。私たちは、0.0037%の窒素ではなく、ほぼ100%の¹⁵N₂で植物を栽培しています。質量分析計を用いて、植物中の¹⁵Nを探すというアイデアです。
ここで、最初のレベルの分析とは何か、そしてJMPワークフロービルダーをどのように活用してそこに到達したかをまとめたいと思います。私たちの生データファイルは実は非常にシンプルです。これはCSVファイルで、ピクセル位置を定義する2つの列と、測定した様々な質量のカウントを含む7つの列で構成されています。
通常、同位体比を調べる場合、まず最初に行うことは、同位体比を構成する2つの質量を取り、同位体比の値のための新しい列を挿入することです。グラフビルダーを使って、ここに表示されているイオン画像を基本的に再構成することができます。こちらは植物の一部における炭素と窒素の画像です。様々な細胞小器官が見えますね。こちらは植物の核です。こちらは葉緑体と呼ばれるものです。
こちらは窒素同位体比の画像で、カラースケールが表示されています。最も濃い青は天然の同位体比、つまり通常の窒素で見られる値を表しています。それより上はすべて¹⁵Nの比率が高く、この場合、植物が生育した¹⁵N₂ガスに由来すると考えられます。
明らかに、種子に接種されたバクテリアが、窒素を固定して植物全体に行き渡らせるという役割を果たしたという証拠が得られました。しかし、生成することも可能です。様々なカウントの分布、特に外れ値がどこにあるのかを調べることは非常に有用です。
以前使っていた方法で時間を計ってみました。つまり、基本的に全ての手順を手作業で行っていたのです。画面に表示されている状態になるまでに約3分かかりました。しかし、ワークフロービルダーを使うと、約5秒で完了します。もし1日に20個のファイルを処理しているとしたら、これは1日あたり最大45分から1時間という大幅な時間節約になります。1ヶ月、1年と続けていくと、その差は歴然とした数字になります。
簡単にデモを行って、これがどのように見えるかお見せしましょう。最近開いたファイルを開いて、このファイルを選択します。先ほど言ったように、これがRAWファイルの見た目です。XとYの2つの列があります。これは、それぞれの塊のピクセル位置とカウントです。
では、「ファイル」→「最近使ったファイルを開く」→「パート1 ワークフロービルダー」に進みます。これがワークフロービルダーです。少し縮小してみます。ステップごとに実行してみましょう。新しい列が挿入されます。タイトルは「窒素同位体比」です。計算式を入力すると、比率が計算されます。これが生のCN画像です。これは最初にお見せした画像ですが、スライドでは色付きになっています。実際はグレースケールでした。
窒素同位体比の画像があります。分布を描き、散布図マトリックスとヒートマップを使った単純な多変量統計で仕上げます。ここにある特定の細胞小器官では、同位体比が高くなっているのがわかります。これらは葉緑体と呼ばれています。葉緑体は光合成を担う細胞小器官です。
窒素が優先的にそこに行き渡っているように見えるのは、ほぼ二重のメリットです。なぜなら、窒素が優先的に葉緑体の成長と機能を支えるようになるからです。葉緑体は、大気中の二酸化炭素を吸収し、植物の成長を促すエネルギーに変換する細胞小器官です。気候変動の観点から見ると、これはまさにwin-winの関係です。土壌における合成窒素の必要性が減り、大気中の二酸化炭素の吸収にも貢献していると言えるでしょう。
ところで、ついでにもう一つだけやってみましょう。興味深いのは、硫黄シグナルにおけるこれらの高い外れ値です。これらを選択してみましょう。ご覧の通り、選択されたものはピンク色に変わっています。これらは主に葉緑体でのみ発生しており、場所によって発生頻度が異なります。その理由は、時間的な影響によるものなのか、よく分かりません。
しかし、これは重要な意味を持ちます。なぜなら、窒素固定反応が起こるためには、硫黄を豊富に含む酵素の助けが必要だからです。これは、この特定のサンプルの分析における追加のボーナスでした。
これはワークフロービルダーを使った簡単な第一段階の分析です。これにより、膨大な時間を節約できます。次に、これを含め、ここで行ったすべての作業を終了し、PowerPointに戻って次のスライドに進みます。これは、硫黄が葉緑体に優先的に移動して窒素固定反応を促進する様子を示した部分です。
これは実はかなり単純な分析でしたが、時にはもっと複雑な分析が必要になることもあります。2つ目の例として、セレノプロテインと呼ばれるものについて行った研究があります。健康食品店に行くと、セレンのサプリメントを扱っているコーナーがあるのを見たことがあるでしょう。
これは非常に興味深い分野で、まだ研究の初期段階にあります。セレノプロテインが体内でどのように働くかについては、多くのことが分かっていますが、まだ解明されていない部分も多くあります。セレノプロテインには脳を保護する作用や免疫システムの強化に効果があるという主張や、それを裏付ける証拠があります。抗酸化作用、生殖機能の促進、甲状腺とその機能の補助、そしてDNAの損傷を防ぐ抗変異原性作用も期待されています。
この研究で特に解明したかった疑問は、セレノプロテインは本当にDNAと結合してDNAの完全性を保護するのか、という点です。この点を改めて考えてみると、私たちは非常に高い空間分解能を持つ質量分析イメージングに注目しており、これは実際にこの研究が可能で、かつ十分に効果的な数少ない技術の一つです。
セレンタンパク質の問題は、体内に既に極めて微量しか存在しないことです。「もう少しだけ追加すればいい」と楽に考える人もいるかもしれませんが、体内に過剰にセレンが蓄積すると中毒を起こす可能性があるため、絶対にそうすべきではありません。人工的に過剰なセレンを添加したペトリ皿のサンプルを研究しても、あまり有益な情報にはなりません。
私たちが行ったのは、これらのセレン前駆体、つまりサプリメントのボトルに記載されているような典型的な成分をいくつか用意し、培養培地に、セレンタンパク質の同位体標識前駆体、すなわちセレン強化メチルセレノシステイン、セレン強化セレノメチオニン、または亜セレン酸ナトリウムを300ナノモル添加したものでした。
ここで同位体について話すとき、これらはすべて安定同位体であることを強調しなければなりません。これらは放射性物質などではありません。すべて完全に安全です。
これらを培地に加えましたが、¹⁵Nチミジンも加えました。これは私たちのおなじみの¹⁵N、つまり窒素の重同位体です。このアミノ酸はDNAを選択的に標識します。この二重標識実験で期待しているのは、窒素比が高い場所とセレン比が高い場所の間に相関関係が見られるか、あるいはその逆か、あるいは全く相関がないかどうかです。
先ほど取得した最初の画像を見てみましょう。これは以前のワークビルダーを使った場合の結果です。セレンの含有量が非常に低いことがわかります。これはおそらく予想外のことではありません。なぜなら、セレンは存在量が少なく、私たちが行ったような長時間の計測でも低いからです。この画像取得、左側にあるのがセレン比の画像です。
これはおそらく1日半から2日かけて画像を取得したもので、一次イオンビームでラスター処理されたサンプルからカウントを収集するだけです。比率画像を作成すると、灰色の領域に欠落データや灰色の領域が多数あることがわかります。おそらく、簡単には見えないものがたくさんあるでしょう。
この画像には基本的に2つの細胞があります。これは炭素と窒素の画像で、基本的に細胞のバイオマスを示しています。それ以外の部分、つまり間にある暗黒物質はすべて包埋樹脂です。これらのサンプルはポリマー樹脂に包埋され、ダイヤモンドナイフで非常に薄くスライスされています。カウント数が低いことがわかります。
先に進む前に、「空間解像度を犠牲にして画像をビニングし、カウント数を増やした方が良いかもしれない」と考えていました。JMPを画像解析ソフトウェアに変え始めていることは分かっています。そもそも、そのつもりはなかったのですが。でも、JMPにはダイナミックリンクが満載です。この2つの組み合わせは素晴らしいです。
実際にZIPで閉じて、元に戻します。これはJulian Paris氏のおかげです。昨年、ランチタイムに画像のビン化の方法について議論しました。ここで簡単に説明します。これはワークフロービルダーに組み込まれています。この画像を取得させてください。
これが生データです。ビンニングのコツは、2段階のプロセスです。同位体比はここでは導きませんが、X列とY列を選択します。「ユーティリティ」に移動して、ビンニングの式を作成します。「カットポイント」に移動し、これを4×4の均等なビン幅にビン化します。
ビンを均等に分割します。オフセットは0で問題ありません。これを4に変更して「OK」をクリックし、すべてXにして、数式列を作成します。XビンとYビンの2つの列があります。テーブルに移動してサマリーテーブルを開き、カウント列もすべて曲げたいので、すべて選択します。
「統計」で、そこにあるすべてのデータを合計します。個々のピクセルのカウントをすべて合計して、4×4のビンにまとめます。これはあまり分かりにくかったのですが、XとYでグループ化します。「OK」をクリックします。これでビン化された画像ができたので、グラフビルダーに表示できます。グラフとX、Yです。とりあえずCNで色付けしましょう。ビン化されているので、マーカーのサイズを少し大きくしましょう。
これでカウントが4つ増えました。軸のスケールが少しごちゃごちゃしていますが、他の方が画像で同じことをしているかもしれないので、お見せしておく価値があると思いました。作業を始めた頃は、あまり分かりにくかったので。ここで閉じて、PowerPointに戻りましょう。
画像をビニングした後、窒素同位体比とセレン同位体比を算出しました。分布とヒートマップがすべて取得できました。ヒートマップを見ていると、少し怪しい点がありました。セレン同位体比は、77セレンと80セレンの両方と負の相関関係にあるように見えました。分子と分母の両方に負の相関関係があり、これはおかしいと思いました。1ともう1つの相関関係があるはずだと思いがちですが、そうではありませんでした。
疑問に思い始めました。本当に気になったのは、セレン同位体比とその分布におけるこれらの外れ値です。窒素同位体比にも多くの外れ値が見られます。しかし、カウント率が高いことが分かっているので、それほど気になりません。基本的に、経験から、¹⁵Nチミジン投与、特にマイクロモルレベルでは、そのレベルの同位体比が得られることは分かっています。しかし、この点については確信が持てませんでした。これは未知の領域なのです。
そこで私たちは、「これらの外れ値をもう少し詳しく見てみよう」と決断しました。ロバストフィット外れ値検査を実施したところ、これらのほとんどがロバストフィットアルゴリズムによって外れ値として識別されたことがわかりました。
これらを削除し、ヒートマップと散布図マトリックスを作り直すと、少し分かりやすくなりました。セレン77は比率値に対して非常に小さな正の相関を示し、セレン80はわずかに負の相関を示しました。これでより分かりやすくなりました。
その時点で、「では、簡単なクラスター分析をやってみよう」と考えました。そして実際に実行しました。3つの変数だけを対象に、シンプルなK平均法を実行しました。非常にシンプルな方法です。リン、セレン同位体比、窒素同位体比です。
私たちが発見したいもの、あるいは少なくとも私たちの仮説によれば、セレンタンパク質が実際に DNA と結合して DNA を損傷から守っている場合、高セレンおよび高窒素の両方を有するクラスターが存在するはずです。
しかし、平行線を描いてみると、そのような傾向は見られません。常に一方が他方よりも高いか、その逆、あるいはほぼ同じだが低い水準です。これが、おそらくうまくいっていない、あるいは仮説が間違っているという最初の兆候でした。
セレン同位体比の外れ値を調べてみると、それらはすべてセレン80の極めて低い数値と関連していることがわかりました。正しくは、ここ、セレン77の数値のはずです。実際、それらはすべて基本的にマトリックス、つまり包埋樹脂に埋め込まれていました。
そこで私たちは、「この埋め込み樹脂が分析にバイアスをかけているので、もう一歩踏み込まなければならない。これを排除しなければならない」と考えました。これは簡単にできます。CNと他のいくつかの手法をほぼそのまま使って、もう一度簡単なクラスター分析を行い、2つのクラスターを作成するだけです。CN数が多いことから、これらをすべてセグメント化して、細胞だけを残すことができることは明らかです。そこからテーブルのサブセットを作成し、新しいデータテーブルを作成できます。
こうして得られた散布図マトリックスとヒートマップで、セレン同位体比を見てみましょう。80では負の相関が見られ、77ではより強い正の相関が見られます。これですべてが理解できました。しかし、私たちが本当に注目しているのは、セレン同位体比と窒素同位体比です。これらは完全に負の相関を示しています。つまり、私たちが考えていた現象は実際には起こっていなかったということです。他の領域を見るには、これらのセルを何百個も調べる必要があります。
これで、完全なワークフロービルダーが完成しました。これには、3つの異なる質量、CN、セレン同位体比、窒素同位体比、分布、最初の多変量統計、外れ値分析、K平均法クラスタリング、平行座標プロットのグラフビルダーを3回使用して、4×4の画像ビンが組み込まれています。K平均法は細胞をセグメント化します。
グラフビルダーで新しいデータテーブルが作成されました。多変量統計に進むことができます。これで作業は完了です。ただし、この時点でK-Meansクラスタリングと並列プロットも追加されています。
かなり面白いので、実際に使ってみましょう。「ファイル」→「最近使ったファイルを開く」と進むと、このファイルがあります。次はワークフロービルダーで「最近使ったファイルを開く」を選びます。これがパート2です。さあ、ワークフロービルダーを起動して、リアルタイムで動作する様子を見てみましょう。
最初の画像セット、2番目の画像セット、3番目の画像セット、分布、散布図マトリックス、外れ値分析。次に散布図、K平均法クラスタリング、データサブセット画像。最後に散布図マトリックスです。これで、開いているファイルで実行できます。これにより、大幅な時間節約にもなります。
これは便利です。私がこれらのものを開発して同僚に送れば、彼女がデータを見るときに、わざわざこんなことをする必要がなくて済みます。「実行」ボタンを押すだけで、すべて表示されます。すべて閉じて、これを閉じましょう。
最後にもう1つ。今日は1月ですが、3月には… 実はこれは最後から2番目のことです。そう、忘れていました。全てを終えた後、そのデータのサブセットを使ってK平均法クラスタリングをさらに行いました。繰り返しますが、平行プロットを見ると、様々なクラスターを全て見ても、セレンや窒素の濃度が高い兆候は全く見られません。
最小値10のクラスターを3つ、最大値10のクラスターを3つ作成し、CCC基準で最良と判断されたものを採用します。しかし、いずれの場合も、セレンや窒素の含有量が高いという兆候は見られません。
私たちの結論は、少なくとも直接的には、これらのセレノプロテインが、いわば空間的な結合によってDNAを保護しているという証拠はないということです。しかし、何らかの間接的なメカニズムによって保護されている可能性は依然としてありますが、それはここで私たちが試みていた範囲をはるかに超えています。
最後に、先ほども申し上げたように、まだ1月も終わりに近づいています。3月までには、この件についてもっと詳しくお話しできると思います。しかし、Functional Data Explorer は、おそらく私たちが必要とする別の種類の分析にも役立つだろうと考えています。
冒頭で、各検出器で取得される高質量分解能スペクトルをお見せしました。検出器を設定する際に、実際にどの質量を分析しているのかを知る必要があるため、これらのスペクトルを取得します。多くの場合、多くの質量干渉があるためです。
検出器側のこの領域を拡大して示しましたが、分離されたイオンビームは一連の偏向板を通過し、集束された二次イオンビームを狭いスリットを通して走査し、検出器に入ります。このビームの直径は、スリットの幅よりも狭くなっています。偏向がかなり大きい場合に何が起こるかがお分かりいただけると思います。ビームは実際には検出器に当たらず、スリットの端に当たって検出器に到達しません。
偏向経路によってさらに偏向し、スリットに入り始め、検出器に向かうにつれてカウントが上昇し始めます。ある時点で完全にスリットに入り、基本的にきれいな平坦なピークが見られるようになります。そして、カウントは下がり始めます。別の質量による2番目のピークが見えるかもしれません。それがここにあるのです。再び下がり、最終的に3番目のピークです。
分析中は、対象とするピークを選択し、そのピークだけが検出器を通過するように偏向電圧を設定します。これが正しく設定されていないと、取得したデータはすべて実質的に役に立たなくなってしまいます。
¹⁵Nや¹³Cをよく使うなど、これらの多くについてはスペクトルの形状が分かっています。しかし、セレンについては、特に計数率が非常に低かったため、実際にセレンを使っているかどうかを確認するのは非常に困難でした。
しかし、これを見て、Functional Data Explorer を見始めたとき、ウェーブレットの使用について話し合っていた時に最初に気づいたのは、これらのスペクトルがハールウェーブレットとほぼ正確に似ているということでした。もう一つは、検出器の閾値とゲインを、電子的バックグラウンドが実質的にゼロになり、応答が同じになるように設定しているため、バックグラウンドが実質的にゼロであるということです。
これは、私たちが常に同位体比を測定していたにもかかわらず、2つの異なる検出器を用いて測定していたためです。2つの検出器が互いに正確に較正されていないと、適切な同位体比で測定する能力が低下します。
基本的に、これらのうちの1つの位置とそれが何に割り当てられているかを知るだけで十分です。この場合、この広いピークは¹²Cと¹⁴Nであることが分かっています。これは¹²C、¹³C、¹Hの一部です。これらは両方とも合計26になります。
片方が何であるかが分かれば、質量の差だけでもう片方が何であるかを判断できます。常に質量差を見ているので、このスケールは重要ではありません。常に正確に調整することは可能ですが、それには膨大な労力と作業が必要です。
一つのピークが何であるかが分かれば、他のピークが何であるか、つまり差が何であるかを計算し、それを既存のプログラムに関連付けることができます。基本的に、サンプルに含まれると思われるすべての元素を入力すると、その質量に達する可能性のあるすべての結果と、その特定のピークとの差が出力されます。
もしFDEを使って、デコンボリューションのようにこれら全てを分離できれば、私たちにとって大きなメリットになります。特に、干渉が多く、分離が非常に困難な重い質量を持つ物質ではなおさらです。現時点では、これについて言えることはほぼこれだけです。しかし、会議の頃には、もっと多くの情報、そしてもしかしたらいくつかの例も提供できると思います。
しかし今は、何人かの同僚に感謝の意を表したいと思います。サステイナブル・ナイトロジェン財団のデイビッド・デント博士、ノッティンガム大学のエリック・マーチー教授、テッド・コッキング教授です。彼らはGD細菌による窒素固定に関する最初の症例研究において重要な役割を果たしました。ハーバード大学医学部のダイアン・ハンディ博士とクロード・レシェーン教授にも感謝の意を表したいと思います。彼らはセレノプロテイン研究においても不可欠な存在でした。そして、NPLのNiCE-MSIの同僚全員にも感謝の意を表したいと思います。
大変残念なお知らせですが、テッドとクロードは亡くなりました。科学界にとって大きな損失ですが、今回の講演や今後の多くの講演を通して、彼らの思い出は語り継がれていきます。本当にありがとうございました。ご質問があれば、喜んでお答えいたします。
