Nel malaugurato Summit del 2020 a Monaco, che ha dimostrato l'incredibile capacità di cambiamento degli organizzatori del Summit JMP, abbiamo mostrato le nostre applicazioni iniziali di JMP all'analisi di immagini di spettrometria di massa ad alta risoluzione spaziale (NanoSIMS).
In questa presentazione, forniremo un aggiornamento sui progressi compiuti da allora. Dopo una rapida panoramica delle nostre procedure analitiche più basilari che utilizzano il collegamento dinamico e Graph Builder, passeremo ad analisi più avanzate che includono l'analisi dei cluster e, infine, alle applicazioni di JMP Pro Functional Data Explorer, dimostrando come ci aiuti nell'interpretazione degli spettri di massa.
Ora possiamo eseguire molte di queste analisi molto più rapidamente, grazie al Workflow Builder recentemente introdotto in JMP 17. Ci basiamo su set di dati di esempio che spaziano dalla ricerca sul cancro (tessuto tumorale canceroso) all'inverdimento dei fertilizzanti del suolo mediante l'uso di batteri. Per ciascuno di questi studi, introduciamo brevemente la loro importanza, dopodiché la maggior parte della presentazione consiste in una dimostrazione dal vivo dei passaggi che seguiamo per arrivare al risultato finale.
Buongiorno a tutti. Mi chiamo Greg McMahon e sono uno scienziato principale che lavora presso il National Physical Laboratory di Teddington, nel Regno Unito. Oggi vi parlerò dei progressi nell'utilizzo di JMP e JMP Pro per l'analisi di immagini di spettrometria di massa ad alta risoluzione spaziale.
Questo intervento è una continuazione di quanto presentato circa 4 anni fa in quella sfortunata riunione di Monaco, dove il COVID si è messo di mezzo e l'ha trasformata molto rapidamente in una riunione online. La capacità delle persone che si sono subito attivate per trasformare quella riunione online in un evento di grande successo è ancora incredibile. Sono lieto di essere qui con voi oggi, di persona e online, e non vedo l'ora di presentare il mio intervento e di parlare con voi per tutta la settimana.
Per iniziare, parlerò di NanoSIMS come mezzo per ottenere immagini di spettrometria di massa ad alta risoluzione spaziale. C'è un'immagine dello strumento qui a sinistra. Ce ne sono circa 55 in tutto il mondo. Vengono utilizzati per varie applicazioni. La nostra è probabilmente per l'80% biologica e per il 20% in scienze fisiche, metallurgia, scienza dei materiali, semiconduttori, se preferite.
Ma in poche parole, molto brevemente, come funziona lo strumento? Generiamo un fascio di ioni, li acceleriamo e li concentriamo verso il campione di interesse. Quando questo fascio di ioni colpisce il campione, l'energia che viene trasmessa al campione provoca l'espulsione di atomi e molecole dalla superficie del campione. In questo processo, una piccola frazione di queste specie espulse viene effettivamente ionizzata.
Una volta ionizzati e dotati di carica grazie all'applicazione di campi elettrostatici elevati, possiamo raccoglierli e concentrarli lungo quella che chiamiamo colonna secondaria, per poi convogliarli in un magnete. Utilizziamo uno spettrometro di massa a settore magnetico. Questo strumento separa gli ioni in base al loro rapporto massa/carica, in modo molto simile a come un prisma separa la luce nelle sue diverse lunghezze d'onda.
Una volta avvenuta la separazione, abbiamo quella che chiamiamo una camera multi-raccolta, che ospita sette rilevatori. Sei di questi sono montati su carrelli motorizzati, quindi possiamo spostarli nella posizione desiderata. Il settimo rilevatore è fissato al raggio più alto del magnete. In genere, la nostra massa più elevata verrebbe posizionata su quel rilevatore fisso, e gli altri sei verrebbero posizionati di conseguenza.
Davanti a ciascun rivelatore, possiamo acquisire quello che chiamiamo uno spettro di massa ad alta risoluzione, che vediamo qui. In genere contiene picchi multipli che sono indicativi di quelle che chiamiamo interferenze di massa. Ne parlerò più approfonditamente verso la fine del mio intervento. Ma in realtà, i principali vantaggi di questo metodo sono riportati in fondo alla diapositiva. Otteniamo una risoluzione spaziale estremamente elevata. Possiamo spingerla fino a circa 35 nanometri. 100 nanometri sono un valore abbastanza tipico, e non richiedono un grande sforzo per essere raggiunti.
Otteniamo anche un'elevata risoluzione di massa, con un rapporto m/delta m di circa 15.000-20.000. Questo ci permette di separare i picchi, come quelli che vedete negli spettri di massa qui. Poiché si tratta di una tecnica di spettrometria di massa o SIMS, la chiamiamo spettrometria di massa a ioni secondari, otteniamo una sensibilità molto elevata fino a livelli di PPM e PPB.
Oggi vi parlerò di un paio di casi di studio su come abbiamo fatto progressi. L'ultima volta ho parlato di come lo applichiamo alla ricerca sul cancro. Oggi non ne parlerò. Il primo sarà un esempio piuttosto semplice di come abbiamo implementato il Workflow Builder nel nostro flusso di lavoro. È stata una vera manna dal cielo.
Il primo caso di studio di cui parlerò riguarda fondamentalmente i fertilizzanti azotati che utilizziamo per favorire la crescita delle piante e il loro effetto sul cambiamento climatico. In tutto il mondo, è proprio la disponibilità di azoto fissato a limitare la produzione agricola. Sfortunatamente, si fa spesso uso di questi fertilizzanti azotati sintetici, che possono causare inquinamento atmosferico da ammoniaca e protossido di azoto durante la loro produzione. Possono anche emettere smog e trovare un particolare inquinamento anche durante la produzione. Una volta applicati, possono effettivamente causare l'acidificazione dell'ecosistema e la nitrificazione dei corsi d'acqua e, in generale, sono dannosi per il cambiamento climatico.
Ciò che è stato scoperto non molto tempo fa, forse 30 o 40 anni fa, è che alcuni batteri hanno la straordinaria capacità di catturare l'azoto inerte dall'atmosfera, l'N₂, e di fissarlo e convertirlo in ammoniaca, che può poi essere rilasciata nella pianta per la sintesi di amminoacidi, clorofilla e proteine. Di fatto, può sostituire quegli odiosi fertilizzanti azotati sintetici di cui parlavamo prima.
Tuttavia, nessuno ha mai dimostrato questo fenomeno su scala micro-nano-microscopica nelle piante. Sono state condotte analisi di massa di ogni tipo che lo dimostrano, ma volevamo analizzarlo in modo molto più dettagliato e con una risoluzione spaziale molto più elevata.
Questa particolare dimostrazione mostrerà come abbiamo preso le foglie da una pianta che è stata coltivata, in questo caso il mais, in un'atmosfera con 15 di azoto, senza l'aggiunta di altri fertilizzanti sintetici. Non esiste altra fonte di ¹⁵N₂ che possa essere possibile. Forse dovrei tornare un po' indietro. ¹⁵N è un isotopo pesante dell'azoto. Il rapporto naturale è di circa lo 0,0037%. Quello che stiamo facendo è coltivarla in quasi il 100% di ¹⁵N₂ invece che con 0,0037 N₂. La nostra idea è di usare la spettrometria di massa per cercare ¹⁵N nella pianta.
A questo punto, credo che riassumerò il nostro primo livello di analisi e come abbiamo utilizzato JMP Workflow Builder per arrivarci. I nostri file di dati grezzi sono in realtà piuttosto semplici. Si presenta come un file CSV con due colonne che definiscono le posizioni dei pixel e poi sette colonne, o più o meno, che contengono i conteggi delle varie masse che misuriamo.
In genere, la prima cosa che faremmo, se stiamo esaminando i rapporti isotopici, è prendere le due masse che compongono il rapporto e inserire una nuova colonna per il valore del rapporto isotopico. Quello che possiamo fare è andare in Graph Builder e ricostruire le immagini degli ioni che vediamo qui. Questa immagine qui è l'immagine del carbonio più azoto di una sezione della pianta. Vedete questi vari organelli. Questo qui è il nucleo di una pianta. Questi qui sono quelli che chiamiamo cloroplasti.
Questa immagine qui sopra è l'immagine del rapporto isotopico dell'azoto, dove abbiamo una scala di colori. Il blu più scuro rappresenta il rapporto naturale, quello che ci aspetteremmo dall'azoto normale. Tutto ciò che sta sopra è un rapporto elevato in ¹⁵N che, in questo caso, poteva provenire solo dal gas ¹⁵N₂ in cui queste piante sono state coltivate.
Chiaramente, ora abbiamo la prova che i batteri, i semi, sono stati inoculati per questi batteri, che hanno svolto il loro compito, fissando l'N₂ e distribuendolo in tutta la pianta. Ma potremmo anche generarlo. È molto utile osservare la distribuzione dei vari conteggi, soprattutto osservando dove si trovano i valori anomali.
Ho cronometrato il tempo come facevo prima, ovvero eseguendo tutti questi passaggi manualmente. Ci sono voluti circa 3 minuti per arrivare al punto mostrato qui sullo schermo. Ma ora, con Workflow Builder, ci vogliono circa 5 secondi. Se gestiamo 20 di questi file al giorno, questo può rappresentare un notevole risparmio di tempo, fino a circa 45 minuti/un'ora al giorno. Nel corso di un mese e di un anno, il tutto si somma.
Farò una rapida dimostrazione per mostrarvi come appare. Apriamo un file recente e scelgo questo. Come ho detto, ecco come appare il file raw. Due colonne, X e Y. Queste sono le posizioni dei pixel e i conteggi in ciascuna delle nostre masse.
Ora vado su File, Apri recenti e Parte uno, Generatore di flussi di lavoro. Ecco il nostro Generatore di flussi di lavoro. Forse lo rimpicciolirò un po'. Procediamo passo dopo passo. Viene inserita una nuova colonna. Le viene assegnato un titolo, Rapporto isotopico dell'azoto. Viene fornita una formula, ovvero viene calcolato il rapporto. Questa è la nostra immagine CN grezza. Questa è stata la prima immagine che vi ho mostrato, solo che lì è colorata sulla diapositiva. In realtà era in scala di grigi.
Ecco l'immagine del rapporto isotopico dell'azoto. Possiamo concludere con le distribuzioni e poi con le semplici statistiche multivariate con la matrice del diagramma di dispersione e la mappa di calore. Abbiamo visto che i rapporti erano più alti in questi particolari organelli. Sono quelli che chiamiamo cloroplasti. I cloroplasti sono organelli responsabili della fotosintesi.
Il fatto che l'azoto sembri dirigersi preferenzialmente lì è quasi un doppio vantaggio, perché ora l'azoto è destinato a supportare la crescita e la funzione dei cloroplasti. Ma i cloroplasti sono gli organelli che prelevano la CO₂ dall'atmosfera e la convertono in energia che stimola la crescita delle piante. Dal punto di vista del cambiamento climatico, questa è in realtà una vittoria per tutti. Stiamo riducendo la necessità di azoto sintetico nei nostri terreni e stiamo contribuendo, forse assorbendo CO₂ dall'atmosfera.
Ma già che ci sono, vorrei fare un'altra cosa. La cosa interessante sono stati questi valori anomali elevati nel segnale dello zolfo. Li selezioneremo. Come vedete, quelli selezionati sono diventati rosa. Si verificano principalmente nei cloroplasti, alcuni più di altri. Il motivo è che non sono del tutto sicuro che si tratti di un effetto temporale.
Ma questo è significativo, perché affinché la reazione di fissazione dell'azoto avvenga, è necessario l'intervento di un enzima ricco di zolfo. Questo ha rappresentato un ulteriore vantaggio per l'analisi di questo particolare campione.
Questa è solo una rapida analisi di primo livello con Workflow Builder. Fa risparmiare un sacco di tempo. Quello che farò ora è chiudere tutto qui, incluso quello, poi tornare alla presentazione PowerPoint e passare alla diapositiva successiva. Questa è la parte in cui vi ho appena mostrato lo zolfo che si dirige preferibilmente verso il cloroplasto, favorendo la reazione di fissazione dell'azoto.
In realtà, si è trattato di un'analisi piuttosto semplice, ma a volte ne troviamo altre che richiedono molta più complessità. Il secondo esempio che userò è uno studio che abbiamo condotto sulle cosiddette selenoproteine. Se andate in un negozio di prodotti naturali, probabilmente avrete visto una sezione specifica in cui sono esposti questi integratori di selenio.
È un campo molto interessante, in quanto è ancora agli inizi. Si sa molto, ma molto è ancora sconosciuto, sul funzionamento delle selenoproteine nell'organismo. Sono state avanzate alcune affermazioni e prove a sostegno di ciò, secondo cui potrebbero avere un effetto protettivo sul cervello, essere efficaci nel supportare il sistema immunitario. Potrebbero avere proprietà antiossidanti, favorire la riproduzione, supportare la tiroide e la sua funzionalità, e avere anche effetti antimutageni, che possono aiutare a prevenire danni al DNA.
L'unica domanda che volevamo specificamente affrontare in questo studio era: le selenoproteine si associano davvero al DNA per contribuire a proteggerne l'integrità? A tal proposito, stiamo esaminando l'imaging della spettrometria di massa ad altissima risoluzione spaziale, che è in realtà una delle poche tecniche in grado di farlo con ragionevole efficacia.
Il problema con le selenoproteine è che sono già presenti in quantità molto, molto basse nell'organismo. Per semplificare, si potrebbe dire: "Aggiungiamone solo un po' di più", ma in realtà non si vuole farlo perché si può anche intossicarsi da selenio se se ne ha troppo nell'organismo. Studiare campioni in una capsula di Petri a cui è stato aggiunto artificialmente troppo selenio non è molto illuminante.
Quello che abbiamo fatto è stato avere alcuni di questi precursori del selenio, che sono gli ingredienti tipici che si trovano in quelle confezioni di integratori. Avevamo terreni di coltura con l'aggiunta di 300 nanomolari di questi precursori marcati con isotopi per le selenoproteine, 76 metilselenocisteina arricchita con selenio, 77 selenometionina arricchita con selenio o 82 selenito di sodio.
Devo sottolineare che, quando parlo di isotopi, si tratta di isotopi stabili. Non sono radioattivi o cose del genere. Sono tutti perfettamente sicuri.
Li abbiamo aggiunti al terreno di coltura, ma abbiamo anche aggiunto timidina ¹⁵N. Questo è il nostro amico, ¹⁵N, l'isotopo pesante dell'azoto. Questo amminoacido etichetterà selettivamente il DNA. Ciò che speriamo di vedere in questo esperimento di doppia etichettatura è una correlazione tra elevati rapporti di azoto e elevati rapporti di selenio, o viceversa, o forse nessuna correlazione.
Se osserviamo le immagini iniziali appena ottenute, come se avessimo utilizzato il nostro Work Builder di prima, scopriamo che i conteggi di selenio sono molto bassi. Probabilmente non è poi così inaspettato perché, ricordiamo, è poco abbondante, anche contando per tutto il tempo che abbiamo fatto. Questa acquisizione di immagini, questa è l'immagine del rapporto di selenio sul lato sinistro.
Ci è voluto probabilmente un giorno e mezzo o due giorni di acquisizione delle immagini, solo per raccogliere i conteggi dal campione mentre veniva rasterizzato dal fascio ionico primario. Quando realizziamo l'immagine del rapporto, vediamo nelle aree grigie tutti questi dati mancanti e tutte queste aree grigie. Probabilmente ce ne sono molti qui che non possiamo vedere altrettanto facilmente.
Abbiamo fondamentalmente due cellule in questa immagine. Questa è l'immagine del carbonio più azoto, che in pratica esamina la biomassa delle cellule. Tutto il resto, tutta questa materia oscura in mezzo, è la resina di inclusione. Questi campioni sono incorporati in una resina polimerica e poi tagliati a spessori molto sottili con una lama diamantata. Vediamo che i conteggi sono bassi.
Prima ancora di procedere oltre, abbiamo pensato: "Potremmo fare meglio a barattare la risoluzione spaziale con più conteggi, suddividendo l'immagine in gruppi". Ora so che sto iniziando a trasformare JMP in un software di analisi delle immagini, cosa che non avrebbe mai dovuto essere. Ma ha tutti questi collegamenti dinamici. Il connubio tra i due è superbo.
Ora chiudo e chiudo il tutto. Devo ringraziare Julian Paris per questo. L'anno scorso, durante la pausa pranzo, stavamo discutendo su come raggruppare le immagini. Ne parlerò brevemente. Ora abbiamo integrato questa funzionalità nel Workflow Builder. Lasciatemi prendere questa immagine qui.
Questi sono i dati grezzi. Il trucco per suddividerli in bin è un processo in due fasi. Non ricaverò i rapporti isotopici qui. Ma quello che faremo è selezionare le colonne X e Y. Andremo su Utilità e poi creeremo una formula di binning. Andrò su Punti di taglio e li suddividerò in bin di larghezza 4x4 uguali.
Ora imposto i contenitori uguali. Offset zero va bene. Lo imposto a quattro, quindi faccio "Ok", e imposto tutto a X, quindi creo le colonne formula. Eccoci con altre due colonne, una con contenitore X e una con contenitore Y. Andiamo alle tabelle, andiamo a una tabella di riepilogo e voglio modificare anche tutte le colonne dei conteggi, quindi le selezionerò tutte.
In Statistiche, voglio sommare tutto ciò che c'è lì. Ora sommerò tutti i conteggi nei singoli pixel in quel contenitore 4x4. Questa era la parte che non era così ovvia: raggrupperemo per X e Y. Andiamo "Ok". Ora abbiamo la nostra immagine raggruppata e possiamo semplicemente mostrarla su Graph Builder. Grafico e X, Y. Per ora coloriamo solo con il nostro CN, quindi sarà... Dato che è raggruppata, aumentiamo leggermente la dimensione del nostro marcatore.
Ora abbiamo altri quattro conteggi. È un po' complicato con le scale degli assi. Comunque, ho pensato che valesse la pena mostrarlo nel caso qualcun altro stesse facendo la stessa cosa con le proprie immagini, dato che non era poi così ovvio quando abbiamo iniziato a lavorarci. Lasciatemi chiudere qui e poi tornare a PowerPoint.
Una volta raggruppate le immagini, abbiamo ricavato il rapporto isotopico dell'azoto e il rapporto isotopico del selenio. Abbiamo ottenuto tutte le nostre distribuzioni e la nostra mappa termica. Osservando la mappa termica, qualcosa sembrava un po' sospetto. Il rapporto isotopico del selenio sembrava avere una correlazione negativa sia con il selenio 77 che con il selenio 80. Abbiamo una correlazione negativa sia con il numeratore che con il denominatore, il che non sembrava corretto. Si penserebbe che fosse 1 e poi l'altro, ma non è così.
Abbiamo iniziato a interrogarci. Ciò che ci incuriosiva davvero erano tutti questi valori anomali nel rapporto isotopico del selenio e nella sua distribuzione. Notiamo anche molti dati sul rapporto isotopico dell'azoto. Ma questo non ci preoccupa più di tanto perché sappiamo che il tasso di conteggio è più alto. In pratica, solo per esperienza, sappiamo che possiamo ottenere quel livello di rapporto isotopico attraverso la somministrazione di timidina ¹⁵N, soprattutto a livello micromolare. Ma di questo non eravamo sicuri. È un territorio inesplorato.
Ciò che abbiamo fatto quindi è stato decidere: "Diamo un'occhiata più da vicino a questi valori anomali". Abbiamo eseguito un'analisi robusta dei valori anomali e abbiamo scoperto che la maggior parte di essi erano stati effettivamente identificati come valori anomali tramite l'algoritmo di adattamento robusto.
Una volta rimossi questi elementi e rielaborata la mappa di calore e la matrice del diagramma di dispersione, ora le cose sembrano avere un po' più senso. Il selenio 77 aveva una correlazione positiva molto piccola e quello 80 leggermente negativa1 per il valore del rapporto. Questo ha acquisito più senso.
A quel punto, abbiamo pensato: "Proviamo a fare una semplice analisi dei cluster". L'abbiamo fatto. Abbiamo fatto una semplice K-Means, considerando solo tre variabili. Molto semplice. Fosforo, rapporto isotopico del selenio e rapporto isotopico dell'azoto.
Ciò che speriamo di trovare, o almeno secondo la nostra ipotesi, dovrebbe essere un cluster in cui abbiamo sia alti livelli di selenio che di azoto nel caso in cui le selenoproteine si associno effettivamente al DNA per aiutarlo a proteggersi da alcuni danni al DNA.
Ma osserviamo i grafici paralleli e non lo vediamo mai. È sempre 1 più alto dell'altro o viceversa, oppure sono più o meno uguali, ma a un livello più basso. Questa è stata la nostra prima indicazione che forse non funziona, o che la nostra ipotesi è errata.
Quando abbiamo esaminato questi valori anomali nel rapporto isotopico del selenio, abbiamo scoperto che erano tutti associati a conteggi estremamente bassi di selenio pari a 80. In realtà, dovrebbero essere inferiori a 77. In effetti, erano tutti incorporati fondamentalmente nella matrice o nella resina di inclusione.
Questo ci ha portato a pensare: "Dobbiamo fare un ulteriore passo avanti perché tutta questa resina di inclusione sta distorcendo la nostra analisi. Dobbiamo liberarcene". È facile. Possiamo semplicemente fare un'altra rapida analisi dei cluster, in pratica, usando solo CN e un paio di altri, e fare solo due cluster, e sarà ovvio, grazie all'elevato numero di CN, che possiamo segmentare tutto e poi lasciare le cellule indietro. Possiamo creare un sottoinsieme di tabella da questo e ottenere una nuova tabella dati con cui lavorare.
Questo ci fornisce questa matrice di dispersione e questa mappa di calore, dove ora osserviamo il rapporto isotopico del selenio. Vediamo che a 80 c'è una correlazione negativa; a 77 c'è una correlazione positiva molto più forte. Ora tutto ha senso. Ma ciò che ci interessa veramente è il rapporto isotopico del selenio e il rapporto isotopico dell'azoto, che ora mostra una correlazione completamente negativa. Ciò significa che ciò che pensavamo stesse accadendo non è accaduto. Per analizzare altre aree, dovremmo esaminare centinaia di queste cellule.
Ora abbiamo il nostro Workflow Builder completo, che incorpora bin 4 per 4 dell'immagine utilizzando tre volte un Graph Builder per tre masse diverse, il CN, il rapporto isotopico del selenio, il rapporto isotopico dell'azoto, le distribuzioni, le statistiche multivariate la prima volta, un'analisi dei valori anomali, il clustering K-Means e i grafici delle coordinate parallele. K-Means per segmentare le celle.
La nuova tabella dati viene creata con Graph Builder. Possiamo continuare con le statistiche multivariate. A questo punto, abbiamo concluso. Ma a questo punto abbiamo aggiunto anche un altro clustering K-Means e un grafico parallelo.
Potremmo anche mostrarvi come funziona, perché è piuttosto divertente. Andiamo su File, Apri recenti, e questo è questo file. Ora andremo su Apri recenti con il Workflow Builder. Questa è la seconda parte, questa è quella. Lo avvieremo e lo guarderemo fare il suo lavoro in tempo reale.
Ecco il primo set di immagini, il secondo set, il terzo, le distribuzioni, la matrice del grafico a dispersione, l'analisi degli outlier. Poi, il grafico a dispersione, il clustering K-Means, l'immagine del sottoinsieme di dati. Infine, l'ultima matrice del grafico a dispersione. Ora possiamo eseguirla direttamente sul file di apertura. Anche questo ci fa risparmiare un'enorme quantità di tempo.
È fantastico perché posso sviluppare queste cose, inviarle alla mia collega e poi, quando lei guarda i dati, non deve fare tutto questo. Basta che prema il pulsante "Vai" e tutto è lì per lei. Chiudiamo tutto e chiudiamo anche questo.
Un'ultima cosa. Oggi siamo a gennaio, ma a marzo... In realtà, questa è la penultima cosa. Sì, dimenticavo. Dopo aver finito tutto questo, abbiamo fatto un altro clustering K-Means con quel sottoinsieme di dati. Di nuovo, quello che vediamo con i grafici paralleli è che non c'è assolutamente alcun segno di alti livelli di selenio e azoto quando guardiamo tutti i diversi cluster.
Farei tre cluster da 10, tre cluster da 10 e poi userei quello che è stato identificato come il migliore dal criterio CCC. Ma in ogni caso, non c'è traccia di un alto contenuto di selenio e azoto.
La nostra conclusione è che, almeno direttamente, non ci sono prove che queste selenoproteine proteggano il DNA semplicemente tramite un'associazione in termini spaziali, per così dire. Potrebbe comunque esserci un meccanismo indiretto che lo faccia, ma questo va ben oltre lo scopo di ciò che stavamo cercando di fare qui.
Infine, come ho detto, siamo solo alla fine di gennaio. Spero che entro marzo avrò molto di più da dire sull'argomento. Ma penso che questo sia il modo in cui possiamo usare Functional Data Explorer per un altro tipo di analisi di cui abbiamo bisogno.
All'inizio vi ho mostrato questi spettri ad alta risoluzione di massa che vengono acquisiti da ogni rivelatore. Li acquisiamo perché, quando impostiamo il rivelatore, dobbiamo sapere quale massa stiamo effettivamente analizzando, perché in molti casi abbiamo molte interferenze di massa.
Quello che succede è che ho appena ingrandito questa regione qui all'estremità del rivelatore, il fascio di ioni separato passa attraverso una serie di piastre di deflessione che scansionano il fascio di ioni secondari focalizzato attraverso una stretta fessura, per poi entrare nel rivelatore. Il diametro di questo fascio è più stretto della larghezza della fessura. Potete vedere cosa succede quando la deflessione è piuttosto ampia. Non colpisce realmente il rivelatore; colpisce una parte maggiore del bordo della fessura e non raggiunge il rivelatore.
Il percorso di deflessione lo devia ulteriormente, e inizia a entrare nella fenditura e a dirigersi verso il rivelatore, quindi i conteggi iniziano a salire. A un certo punto, ci si trova completamente all'interno della fenditura, e quindi si può sostanzialmente avere un bel picco superiore piatto, e poi inizia a scendere. Potrebbe esserci un secondo picco da un'altra massa che si potrebbe iniziare a vedere. Questo è ciò che abbiamo qui. Scende di nuovo e infine il terzo.
Durante un'analisi, quello che faremmo sarebbe scegliere il picco su cui vogliamo concentrarci e impostare la tensione di deflessione in modo che solo quel picco o quel picco passino attraverso il rivelatore. Se questa impostazione non è corretta, tutti i dati acquisiti saranno sostanzialmente inutili.
Per molti di questi, come per ¹⁵N, e usiamo spesso ¹³C, sappiamo come appaiono questi spettri. Ma per il selenio, è stata davvero una bella sfida accertarsi che si trattasse effettivamente di selenio, soprattutto perché il tasso di conteggio era così basso.
Ma quando ho analizzato la questione e ho iniziato a usare Functional Data Explorer, la prima cosa che ho notato, discutendo dell'uso delle wavelet, è che questi spettri assomigliano quasi esattamente alle wavelet di Haar. Un altro aspetto interessante è che non c'è praticamente alcun background, perché abbiamo impostato le nostre soglie e i guadagni dei rivelatori per assicurarci che non ci sia sostanzialmente alcun background elettronico e che la risposta sia la stessa.
Dobbiamo farlo perché misuravamo continuamente i rapporti isotopici, ma li misuravamo utilizzando due rilevatori diversi. Se questi due rilevatori non sono calibrati con precisione l'uno rispetto all'altro, la nostra capacità di misurare un rapporto isotopico corretto diminuisce.
In pratica, tutto ciò che ci serve sapere è la posizione di uno di questi e a cosa è assegnato. In questo caso, so che questo picco ampio è ¹²C e ¹⁴N. Questo fa parte di ¹²C, ¹³C, ¹H. La loro somma è 26.
Se sappiamo cos'è l'uno, possiamo capire cos'è l'altro semplicemente dalla differenza nelle masse. Questa scala non ha importanza perché osserviamo sempre le differenze di massa. Possiamo calibrare questo sistema per essere sempre precisi, ma ciò richiede un enorme sforzo e un'enorme quantità di lavoro.
Se sappiamo qual è uno, possiamo calcolare quali sono questi altri picchi, le differenze, e poi associarli a un programma che abbiamo. In sostanza, possiamo inserire tutti gli elementi che pensiamo siano presenti nel campione, e il programma elencherà tutti i possibili risultati che sommati danno quella massa e quindi la differenza associata a quel particolare picco.
Se potessimo usare l'FDE per separare tutto questo come una deconvoluzione, sarebbe un enorme vantaggio per noi, soprattutto in alcune di queste masse più pesanti dove abbiamo più interferenze, e sono molto più difficili da distinguere. Questo è praticamente tutto quello che ho da dire al riguardo per ora. Ma quando arriverà il momento della riunione, spero di avere molto di più e magari anche qualche esempio.
Ma per ora, vorrei solo ringraziare alcuni colleghi: il Dott. David Dent, della Sustainable Nitrogen Foundation, e il Professor Erik Murchie e il Professor Ted Cocking dell'Università di Nottingham. Sono stati fondamentali nel primo studio di caso sulla fissazione dell'azoto da parte dei batteri GD. La Dott.ssa Diane Handy e il Professor Claude Lechene della Harvard Medical School. Sono stati essenziali anche per lo studio sulle selenoproteine, e tutti i miei colleghi del NiCE-MSI presso l'NPL.
Con una nota triste, vorrei solo dire che Ted e Claude sono scomparsi. È una perdita enorme per la comunità scientifica, ma li ricordiamo con questa conferenza e con molte altre a venire. Grazie mille e, se avete domande, sarò lieto di rispondervi.
