Auf dem unglückseligen JMP Summit 2020 in München, der die unglaubliche Flexibilität der JMP Summit-Organisatoren unter Beweis stellte, zeigten wir unsere ersten Anwendungen von JMP zur Analyse von hochauflösenden Massenspektrometrie-Bildern (NanoSIMS).
In diesem Vortrag geben wir einen Überblick über unsere Fortschritte seit der letzten Präsentation. Nach einem kurzen Überblick über unsere grundlegendsten Analyseverfahren, die dynamische Verknüpfungen und den Graph Builder nutzen, gehen wir auf fortgeschrittenere Analysen mit Clusteranalysen ein und zeigen abschließend, wie der JMP Pro Functional Data Explorer uns bei der Interpretation von Massenspektren unterstützt.
Dank des in JMP 17 eingeführten Workflow Builders können wir viele dieser Analysen nun deutlich schneller durchführen. Wir verwenden Beispieldatensätze aus der Krebsforschung (Tumorgewebe) bis hin zur Begrünung von Bodendüngern mithilfe von Bakterien. Für jede dieser Studien erläutern wir kurz deren Bedeutung, bevor wir im Hauptteil des Vortrags die einzelnen Schritte bis zum Endergebnis live demonstrieren.
Guten Morgen zusammen. Mein Name ist Greg McMahon, und ich bin leitender Wissenschaftler am National Physical Laboratory in Teddington, Großbritannien. Ich werde Ihnen heute über Fortschritte bei der Verwendung von JMP und JMP Pro zur Analyse von hochauflösenden Massenspektrometrie-Bildern sprechen.
Dieser Vortrag ist eine Weiterentwicklung dessen, was ich vor etwa vier Jahren bei dem unglückseligen Münchner Treffen präsentiert habe, das aufgrund von COVID-19 kurzfristig in ein Online-Meeting umgewandelt wurde. Die Fähigkeit der Beteiligten, so schnell umzuschwenken und das Online-Meeting zu einem großen Erfolg zu machen, ist immer noch bemerkenswert. Ich freue mich, heute persönlich und online bei Ihnen zu sein und darauf, meinen Vortrag zu halten und mich im Laufe der Woche mit Ihnen auszutauschen.
Zunächst möchte ich auf NanoSIMS als unser Verfahren zur Erzeugung hochauflösender Massenspektrometrie-Bilder eingehen. Links sehen Sie ein Bild des Geräts. Weltweit gibt es nur etwa 55 davon. Sie werden für verschiedene Anwendungen eingesetzt. Unsere Anwendung entfällt zu etwa 80 % auf biologische Forschung und zu etwa 20 % auf physikalische Wissenschaften, Metallurgie, Materialwissenschaften und Halbleitertechnik.
Aber kurz gesagt, wie funktioniert das Gerät? Wir erzeugen einen Ionenstrahl, beschleunigen die Ionen und fokussieren sie auf unsere Probe. Trifft dieser Ionenstrahl auf die Probe, werden durch die zugeführte Energie Atome und Moleküle von der Probenoberfläche abgelöst. Dabei wird ein kleiner Teil der abgelösten Teilchen ionisiert.
Sobald die Ionen durch Anlegen starker elektrostatischer Felder ionisiert und geladen sind, können wir sie sammeln und in einer sogenannten Sekundärsäule fokussieren, bevor wir sie in einen Magneten leiten. Wir verwenden ein magnetisches Sektor-Massenspektrometer. Dieses trennt die Ionen nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis, ähnlich wie ein Prisma Licht in seine verschiedenen Wellenlängen zerlegt.
Sobald diese Trennung erfolgt ist, verfügen wir über eine sogenannte Multikollektorkammer mit sieben Detektoren. Sechs dieser Detektoren befinden sich auf motorisierten Wagen und können so beliebig positioniert werden. Der siebte Detektor ist am größten Radius im Magneten fixiert. Typischerweise wird die größte Masse auf diesem fixierten Detektor platziert, die anderen sechs werden entsprechend positioniert.
Vor jedem Detektor können wir ein sogenanntes Massenspektrum mit hoher Massenauflösung aufnehmen, das wir hier sehen. Es enthält typischerweise mehrere Peaks, die auf sogenannte Masseninterferenzen hinweisen. Ich werde dies gegen Ende meines Vortrags noch genauer erläutern. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode sind jedoch unten auf der Folie aufgeführt. Wir erreichen eine extrem hohe Ortsauflösung. Diese kann bis auf etwa 35 Nanometer reduziert werden. 100 Nanometer sind ein üblicher Wert und lassen sich relativ einfach erzielen.
Wir erzielen außerdem eine hohe Massenauflösung von m/Δm im Bereich von etwa 15.000–20.000. Dies ermöglicht uns die Trennung von Peaks, wie sie beispielsweise in den hier gezeigten Massenspektren zu sehen sind. Da es sich um eine massenspektrometrische Technik bzw. eine SIMS-Technik handelt – wir nennen sie Sekundärionen-Massenspektrometrie –, erreichen wir eine sehr hohe Empfindlichkeit bis in den ppm- und ppb-Bereich.
Ich möchte Ihnen heute einige Fallstudien vorstellen, die zeigen, wie wir Fortschritte erzielt haben. Letztes Mal habe ich darüber gesprochen, wie wir es in der Krebsforschung anwenden. Darauf gehe ich heute nicht ein. Mein erstes Beispiel ist recht einfach und zeigt, wie wir den Workflow Builder in unseren Arbeitsablauf integriert haben. Er war wirklich ein Glücksfall.
Die erste Fallstudie, die ich vorstellen möchte, befasst sich mit Stickstoffdüngern, die wir zur Förderung des Pflanzenwachstums einsetzen, und deren Auswirkungen auf den Klimawandel. Weltweit ist die Verfügbarkeit von gebundenem Stickstoff der limitierende Faktor für die landwirtschaftliche Produktion. Leider werden häufig synthetische Stickstoffdünger verwendet, deren Herstellung durch Ammoniak und Lachgas die Luft verschmutzt. Sie können auch Smog verursachen und somit weitere Schadstoffe freisetzen. Nach der Ausbringung können sie zur Versauerung von Ökosystemen und zur Nitrifikation von Gewässern führen und sind generell schädlich für das Klima.
Vor nicht allzu langer Zeit, vielleicht vor 30 oder 40 Jahren, wurde entdeckt, dass bestimmte Bakterien die erstaunliche Fähigkeit besitzen, inerten Stickstoff (N₂) aus der Atmosphäre aufzunehmen, ihn zu fixieren und in Ammoniak umzuwandeln. Dieses Ammoniak kann dann von der Pflanze zur Synthese von Aminosäuren, Chlorophyll und Proteinen genutzt werden. Im Prinzip kann es die zuvor erwähnten, schädlichen synthetischen Stickstoffdünger ersetzen.
Bisher hat jedoch noch niemand dies im Mikro- bis Nanobereich an Pflanzen nachgewiesen. Zwar wurden bereits diverse Analysen von Gesamtproben durchgeführt, die dies belegen, wir wollten das Ganze aber in einer deutlich höheren räumlichen Auflösung und mit wesentlich detaillierteren Informationen untersuchen.
Diese Demonstration zeigt, wie wir Blätter einer Pflanze – in diesem Fall Mais – entnommen haben, die in einer Atmosphäre mit ¹⁵N₂ (¹⁵N) angebaut wurde, ohne dass weitere synthetische Düngemittel verwendet wurden. Es gibt keine andere mögliche Quelle für ¹⁵N₂. ¹⁵N ist ein schweres Stickstoffisotop. Sein natürliches Verhältnis liegt bei etwa 0,0037 %. Wir kultivieren die Pflanze in nahezu 100 % ¹⁵N₂ anstatt in 0,0037 % ¹⁵N₂. Wir wollen die Pflanze anschließend mittels Massenspektrometrie auf ¹⁵N untersuchen.
Ich denke, an dieser Stelle fasse ich kurz zusammen, was unsere erste Analyseebene ist und wie wir den JMP Workflow Builder dafür eingesetzt haben. Unsere Rohdatendateien sind recht einfach. Es handelt sich um eine CSV-Datei mit zwei Spalten, die die Pixelpositionen definieren, und sieben weiteren Spalten (oder mehr), die die Zählwerte der verschiedenen gemessenen Massen enthalten.
Normalerweise würden wir als Erstes, wenn wir Isotopenverhältnisse betrachten, die beiden Massen, aus denen sich das Verhältnis zusammensetzt, nehmen und eine neue Spalte für den Wert des Isotopenverhältnisses einfügen. Wir können aber auch den Graph Builder verwenden und die hier gezeigten Ionenbilder rekonstruieren. Dieses Bild hier zeigt das Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis eines Pflanzenabschnitts. Man sieht die verschiedenen Organellen. Dies hier ist ein Pflanzenkern. Dies hier sind Chloroplasten.
Dieses Bild hier zeigt das Stickstoffisotopenverhältnis mit einer Farbskala. Das dunkelste Blau repräsentiert das natürliche Verhältnis, das man von normalem Stickstoff erwarten würde. Alle Werte darüber zeigen erhöhte ¹⁵N-Verhältnisse, die in diesem Fall nur vom ¹⁵N₂-Gas stammen können, in dem die Pflanzen aufgezogen wurden.
Es ist nun eindeutig belegt, dass die Bakterien – die Samen wurden mit diesen Bakterien beimpft – ihre Aufgabe erfüllt haben, indem sie den Stickstoff (N₂) binden und in der gesamten Pflanze verteilen. Es ist jedoch sehr hilfreich, die Verteilungen der verschiedenen Messwerte zu betrachten und insbesondere die Ausreißer zu identifizieren.
Ich habe die Zeit gestoppt, indem ich die Schritte manuell ausgeführt habe. Das dauerte etwa 3 Minuten, bis ich an dem Punkt angelangt war, den ich hier auf dem Bildschirm gezeigt habe. Mit dem Workflow Builder dauert es jetzt nur noch etwa 5 Sekunden. Bei 20 dieser ungewöhnlichen Dateien pro Tag ergibt das eine erhebliche Zeitersparnis von bis zu 45 Minuten bis zu einer Stunde täglich. Über einen Monat und ein Jahr summiert sich das.
Ich zeige Ihnen kurz, wie das aussieht. Öffnen Sie einfach eine kürzlich verwendete Datei – ich wähle diese hier. Wie gesagt, so sieht die Rohdatei aus. Zwei Spalten, X und Y. Das sind die Pixelpositionen und die Anzahl der Pixel in jeder Masse.
Jetzt gehe ich auf „Datei“, „Zuletzt geöffnet“ und dann auf „Teil 1: Workflow-Builder“. Da ist er also, unser Workflow-Builder. Ich verkleinere ihn vielleicht noch etwas. Gehen wir ihn Schritt für Schritt durch. Eine neue Spalte wird eingefügt. Sie erhält den Titel „Stickstoffisotopenverhältnis“. Eine Formel wird angegeben, das heißt, das Verhältnis wird berechnet. Das ist unser Rohbild des CN-Isotopenverhältnisses. Das war das erste Bild, das ich Ihnen gezeigt habe, nur dass es dort auf dem Folienbild farbig dargestellt ist. Es war eigentlich in Graustufen.
Hier ist das Bild des Stickstoffisotopenverhältnisses. Zum Schluss betrachten wir noch die Verteilungen und anschließend die einfache multivariate Statistik mit der Streudiagrammmatrix und der Heatmap. Wir haben gesehen, dass die Verhältnisse in diesen Organellen höher waren. Das sind die sogenannten Chloroplasten. Chloroplasten sind Organellen, die für die Photosynthese verantwortlich sind.
Dass der Stickstoff bevorzugt dorthin gelangt, ist beinahe ein doppelter Gewinn, denn nun wird er gezielt für das Wachstum und die Funktion der Chloroplasten genutzt. Die Chloroplasten wiederum sind die Organellen, die CO₂ aus der Atmosphäre aufnehmen und in Energie umwandeln, die das Pflanzenwachstum antreibt. Aus Sicht des Klimawandels ist dies also eine Win-win-Situation. Wir reduzieren den Bedarf an synthetischem Stickstoff in unseren Böden und tragen gleichzeitig dazu bei, CO₂ aus der Atmosphäre zu binden.
Aber da ich schon mal hier bin, mache ich noch eine Sache. Interessant waren diese Ausreißer im Schwefelsignal. Wir wählen sie jetzt aus. Wie Sie sehen, haben sich die ausgewählten Werte rosa verfärbt. Diese Ausreißer treten hauptsächlich in den Chloroplasten auf, manche stärker als andere. Der Grund dafür ist mir noch nicht ganz klar; es könnte sich um einen zeitlichen Effekt handeln.
Dies ist jedoch von Bedeutung, da die Stickstofffixierungsreaktion die Unterstützung eines Enzyms benötigt, das zufällig reich an Schwefel ist. Dies war ein zusätzlicher Vorteil bei der Analyse dieser speziellen Probe.
Das war nur eine kurze erste Analyse mit dem Workflow Builder. Das spart enorm viel Zeit. Als Nächstes schließe ich alles hier, inklusive dieser Analyse, und wechsle zurück zu PowerPoint, um zur nächsten Folie zu gehen. Dort habe ich Ihnen gerade gezeigt, wie der Schwefel bevorzugt in die Chloroplasten gelangt und so die Stickstofffixierung unterstützt.
Das war eigentlich eine recht einfache Analyse, aber manchmal gibt es auch Fälle, die deutlich komplexer sind. Das zweite Beispiel, das ich anführen möchte, ist eine Studie, die wir zu sogenannten Selenoproteinen durchgeführt haben. Wenn Sie in einem Reformhaus oder Drogeriemarkt waren, haben Sie wahrscheinlich schon einmal die Abteilung mit Selenpräparaten gesehen.
Es handelt sich um ein sehr interessantes, aber noch junges Forschungsgebiet. Vieles ist bereits bekannt, doch vieles ist noch unbekannt darüber, wie Selenoproteine im Körper wirken. Es gibt Behauptungen und Belege dafür, dass sie das Gehirn schützen und das Immunsystem stärken können. Sie besitzen möglicherweise antioxidative Eigenschaften, unterstützen die Fortpflanzung, fördern die Schilddrüsenfunktion und wirken antimutagen, wodurch DNA-Schäden vorgebeugt werden kann.
Die zentrale Frage dieser Studie lautete: Binden Selenoproteine tatsächlich an die DNA und tragen so zum Schutz ihrer Integrität bei? In diesem Zusammenhang nutzen wir die Massenspektrometrie mit sehr hoher räumlicher Auflösung – eine der wenigen Techniken, die dies mit hinreichender Effektivität leisten kann.
Das Problem mit Selenoproteinen ist, dass sie im Körper bereits in sehr geringer Menge vorkommen. Um es einfacher zu machen, könnte man sagen: „Wir fügen einfach etwas mehr hinzu“, aber davon ist dringend abzuraten, da eine Selenüberdosierung zu einer Vergiftung führen kann. Untersuchungen von Proben in Petrischalen, denen künstlich zu viel Selen zugesetzt wurde, liefern keine besonders aussagekräftigen Ergebnisse.
Wir verwendeten Selenvorstufen, typische Bestandteile von Nahrungsergänzungsmitteln. Unseren Kulturmedien wurden 300 Nanomol dieser isotopenmarkierten Vorstufen für Selenoproteine zugesetzt: 76 Selen-angereichertes Methylselenocystein, 77 Selen-angereichertes Selenomethionin oder 82 Natriumselenit.
Ich möchte betonen, dass ich hier ausschließlich von stabilen Isotopen spreche. Sie sind weder radioaktiv noch sonstwie gefährlich. Sie sind völlig ungefährlich.
Wir haben diese Substanzen dem Kulturmedium hinzugefügt, aber auch ¹⁵N-Thymidin. ¹⁵N ist das schwere Stickstoffisotop. Diese Aminosäure markiert selektiv die DNA. Wir hoffen, in diesem Doppelmarkierungsexperiment eine Korrelation zwischen hohen Stickstoff- und Selenkonzentrationen zu beobachten, oder umgekehrt, oder vielleicht auch gar keine Korrelation.
Betrachten wir die ersten aufgenommenen Bilder – so wäre es gewesen, wenn wir unseren Work Builder von vorhin verwendet hätten –, stellen wir fest, dass die Selenwerte sehr niedrig sind. Das ist vermutlich nicht allzu überraschend, da Selen ja ohnehin selten vorkommt, selbst nach so langer Messdauer. Dieses Bild zeigt das Selenverhältnis auf der linken Seite.
Die Bildaufnahme dauerte vermutlich anderthalb bis zwei Tage, wobei die Zählwerte der Probe während des Rasterdurchlaufs durch den primären Ionenstrahl erfasst wurden. In der Verhältnisbildgebung sehen wir in den Grauzonen die fehlenden Daten. Wahrscheinlich gibt es hier noch viele weitere Informationen, die wir nicht so leicht erkennen können.
In diesem Bild sind im Grunde zwei Zellen zu sehen. Es handelt sich um ein Kohlenstoff-Stickstoff-Bild, das die Biomasse der Zellen darstellt. Alles andere, die dunkle Materie dazwischen, ist das Einbettungsharz. Die Proben werden in ein Polymerharz eingebettet und anschließend mit einem Diamantmesser in sehr dünne Scheiben geschnitten. Wir sehen, dass die Zählrate niedrig ist.
Schon bevor wir überhaupt weitermachten, dachten wir: „Vielleicht wäre es besser, die räumliche Auflösung durch Binning des Bildes zu reduzieren und dadurch mehr Zählwerte zu erzielen.“ Mir ist jetzt klar, dass ich JMP langsam in eine Bildanalyse-Software verwandle, was nie beabsichtigt war. Aber diese dynamische Verknüpfung ist einfach genial. Die Kombination der beiden ist hervorragend.
Ich schließe das Fenster jetzt wieder. Vielen Dank an Julian Paris dafür! Letztes Jahr haben wir in der Mittagspause darüber gesprochen, wie man Bilder in den Papierkorb verschiebt. Ich gehe kurz darauf ein. Wir haben das jetzt in den Workflow Builder integriert. Ich greife mir mal dieses Bild hier vor.
Dies sind die Rohdaten. Die Kategorisierung erfolgt in zwei Schritten. Ich werde die Isotopenverhältnisse hier nicht berechnen. Wir wählen zunächst die Spalten X und Y aus. Anschließend gehen wir zu „Utilities“ und erstellen eine Kategorisierungsformel. Ich wähle „Cut points“ und teile die Daten in vier gleich breite 4x4-Gruppen ein.
Ich werde die Werte in gleich große Gruppen einteilen. Der Versatz von Null ist in Ordnung. Ich ändere das auf vier, mache alles zu X und erstelle dann Formelspalten. Dort haben wir zwei weitere Spalten: X-Gruppe und Y-Gruppe. Wir gehen zu Tabellen, dann zu einer Zusammenfassungstabelle, und ich möchte auch alle Spalten mit den Zählwerten anpassen, also wähle ich sie alle aus.
Unter „Statistik“ möchte ich alle Werte summieren. Jetzt addiere ich alle Zählungen der einzelnen Pixel in diesem 4x4-Bin. Der nicht ganz so offensichtliche Teil ist, dass wir nach X und Y gruppieren. Okay. Jetzt haben wir unser gruppiertes Bild und können es im Graph Builder anzeigen. Graph und X, Y. Wir färben es vorerst mit unserem CN ein, also… Da es gruppiert ist, vergrößern wir die Markergröße etwas.
Jetzt haben wir vier weitere Zählungen. Die Achsenskalierung ist hier etwas unübersichtlich. Aber ich dachte, es wäre trotzdem erwähnenswert, falls jemand anderes das Gleiche mit seinen Bildern macht, da es am Anfang nicht ganz so offensichtlich war. Ich schließe das Fenster jetzt und wechsle zurück zu PowerPoint.
Nachdem wir das Bild gruppiert hatten, ermittelten wir das Stickstoff- und das Selenisotopenverhältnis. Wir erhielten alle Verteilungen und die Heatmap. Beim Betrachten der Heatmap fiel uns etwas Ungewöhnliches auf. Das Selenisotopenverhältnis schien negativ mit sowohl dem 77Selen als auch dem 80Selen zu korrelieren. Wir hatten eine negative Korrelation sowohl im Zähler als auch im Nenner, was uns nicht plausibel erschien. Man würde erwarten, dass es jeweils 1 und dann 1 wäre, aber dem war nicht so.
Wir begannen uns zu wundern. Besonders interessierten uns die vielen Ausreißer im Selen-Isotopenverhältnis und dessen Verteilung. Auch beim Stickstoff-Isotopenverhältnis beobachten wir viele Auffälligkeiten. Das beunruhigt uns aber weniger, da wir wissen, dass die Zählrate höher ist. Erfahrungsgemäß können wir dieses Isotopenverhältnis durch die Gabe von ¹⁵N-Thymidin, insbesondere im mikromolaren Bereich, erreichen. Doch hier waren wir unsicher. Das ist Neuland.
Wir haben dann beschlossen: „Lasst uns diese Ausreißer etwas genauer betrachten.“ Wir haben eine robuste Ausreißeranalyse durchgeführt und festgestellt, dass die meisten davon tatsächlich durch den robusten Anpassungsalgorithmus als Ausreißer identifiziert wurden.
Nachdem wir diese entfernt und die Heatmap sowie die Streudiagrammmatrix neu erstellt hatten, ergaben die Zusammenhänge nun etwas mehr Sinn. Das Selen 77 wies eine sehr geringe positive Korrelation auf, und das Selen 80 hatte einen leicht negativen Wert von -1 im Verhältniswert. Das war plausibler.
An diesem Punkt dachten wir: „Versuchen wir es doch mal mit einer einfachen Clusteranalyse.“ Das haben wir getan. Wir haben eine einfache K-Means-Clusteranalyse durchgeführt und dabei nur drei Variablen betrachtet. Ganz einfach: Phosphor, das Selen-Isotopenverhältnis und das Stickstoff-Isotopenverhältnis.
Wir hoffen, eine Gruppe zu finden, oder zumindest gehen wir davon aus, dass es eine Gruppe geben wird, in der sowohl ein hoher Selen- als auch ein hoher Stickstoffgehalt vorliegt, und zwar in dem Fall, dass die Selenoproteine tatsächlich mit der DNA interagieren, um diese vor bestimmten DNA-Schäden zu schützen.
Aber wir betrachten die parallelen Diagramme und sehen das nie. Es ist immer entweder der eine Wert höher als der andere oder umgekehrt, oder sie sind ungefähr gleich, aber auf einem niedrigen Niveau. Das war unser erster Hinweis darauf, dass es vielleicht nicht funktioniert oder unsere Hypothese falsch ist.
Bei der Untersuchung dieser Ausreißer im Selenisotopenverhältnis stellten wir fest, dass sie alle mit extrem niedrigen Werten von Selen80 einhergingen. Tatsächlich müsste der Wert hier unten liegen, bei Selen77. Sie waren praktisch alle in die Matrix oder das Einbettungsharz eingebettet.
Dies führte uns zu dem Schluss: „Wir müssen noch einen Schritt weitergehen, denn das gesamte Einbettungsharz verfälscht unsere Analyse. Wir müssen es entfernen.“ Das ist ganz einfach. Wir können eine weitere schnelle Clusteranalyse durchführen, im Wesentlichen nur mit CN und einigen anderen Kriterien, und zwei Cluster bilden. Anhand der hohen CN-Werte wird deutlich, dass wir das gesamte Harz herausfiltern und die Zellen zurücklassen können. Daraus können wir eine Tabellenausschnittstabelle erstellen und haben so eine neue Datentabelle, mit der wir arbeiten können.
Dadurch erhalten wir diese Streudiagrammmatrix und die Heatmap, in der wir nun das Selenisotopenverhältnis betrachten. Wir sehen bei 80 eine negative Korrelation; bei 77 ist die positive Korrelation deutlich stärker. Das ergibt nun Sinn. Uns interessiert aber vor allem das Selenisotopenverhältnis und das Stickstoffisotopenverhältnis, das nun eine vollständig negative Korrelation aufweist. Das bedeutet, dass unsere Annahme nicht zutrifft. Um andere Bereiche zu untersuchen, würden wir Hunderte dieser Zellen betrachten.
Wir haben nun unseren vollständigen Workflow-Builder, der die Bilddaten in 4x4-Bins unterteilt und dabei dreimal einen Graph-Builder für drei verschiedene Massen, die Kernladungszahl (CN), das Selen-Isotopenverhältnis, das Stickstoff-Isotopenverhältnis, die Verteilungen, die multivariate Statistik (beim ersten Durchlauf), eine Ausreißeranalyse, das K-Means-Clustering und die Parallelkoordinatendiagramme verwendet. K-Means dient der Segmentierung der Zellen.
Die neue Datentabelle wurde mit dem Graph Builder erstellt. Wir können nun mit multivariaten statistischen Analysen fortfahren. An dieser Stelle sind wir fertig. Wir haben jedoch zusätzlich ein K-Means-Clustering und ein Paralleldiagramm hinzugefügt.
Ich zeige euch das mal, weil es echt Spaß macht. Wir gehen auf „Datei“, dann auf „Zuletzt verwendet“ und hier ist die Datei. Jetzt öffnen wir „Zuletzt verwendet“ mit dem Workflow Builder. Das war’s mit Teil zwei. Wir starten ihn einfach und schauen ihm in Echtzeit zu.
Hier folgen die ersten Bilder, dann die zweiten, die dritten, die Verteilungen, die Streudiagrammmatrix und die Ausreißeranalyse. Anschließend Streudiagramm, K-Means-Clustering und ein Bild des Datenausschnitts. Zum Schluss die letzte Streudiagrammmatrix. Wir können das jetzt direkt nach dem Öffnen der Datei ausführen. Das spart enorm viel Zeit.
Das ist praktisch, denn ich kann diese Dinge entwickeln, sie meiner Kollegin schicken, und wenn sie sich dann die Daten ansieht, muss sie das alles nicht mehr machen. Sie klickt einfach auf „Start“, und alles ist für sie da. Dann können wir das jetzt abschließen.
Noch eine letzte Sache. Wir haben heute Januar, aber im März… Moment, das ist die vorletzte Sache. Stimmt, ich hatte es vergessen. Nachdem wir das alles abgeschlossen hatten, haben wir mit diesem Datensatz noch einmal eine K-Means-Clusteranalyse durchgeführt. Auch hier sehen wir in den parallelen Diagrammen keinerlei Anzeichen für hohe Selen- oder Stickstoffwerte, wenn wir uns die verschiedenen Cluster ansehen.
Ich würde mindestens drei und maximal drei Cluster mit jeweils zehn Clustern erstellen und dann denjenigen verwenden, der nach dem CCC-Kriterium als bester identifiziert wurde. In keinem Fall gibt es jedoch Anzeichen für einen hohen Selen- oder Stickstoffgehalt.
Unsere Schlussfolgerung ist, dass es zumindest direkt keine Beweise dafür gibt, dass diese Selenoproteine die DNA allein durch eine räumliche Anordnung schützen. Es könnte jedoch einen indirekten Mechanismus geben, der dies bewirkt, aber das geht weit über den Rahmen unserer Untersuchung hinaus.
Abschließend möchte ich noch erwähnen, dass wir uns erst Ende Januar befinden. Hoffentlich kann ich im März mehr dazu sagen. Ich denke aber, dass wir den Functional Data Explorer folgendermaßen für eine weitere benötigte Analyse nutzen können:
Ich habe Ihnen ganz am Anfang diese hochauflösenden Massenspektren gezeigt, die an jedem Detektor aufgenommen werden. Wir erfassen diese Spektren, weil wir beim Einstellen des Detektors wissen müssen, welche Masse wir tatsächlich analysieren, da es in vielen Fällen zu starken Masseninterferenzen kommt.
Folgendes passiert: Ich habe diesen Bereich hier am Detektorende vergrößert. Der separierte Ionenstrahl durchläuft Ablenkplatten, die den fokussierten Sekundärionenstrahl durch einen schmalen Spalt lenken, und gelangt dann in den Detektor. Der Durchmesser dieses Strahls ist kleiner als die Spaltbreite. Man kann sehen, was passiert, wenn die Ablenkung sehr groß ist. Der Strahl trifft nicht direkt auf den Detektor, sondern eher auf den Spaltrand.
Durch die Ablenkung wird das Teilchen stärker verschoben und gelangt in den Spalt und auf den Weg zum Detektor, wodurch die Zählrate ansteigt. Ab einem bestimmten Punkt befindet es sich vollständig im Spalt, und es bildet sich ein flaches Maximum, bevor die Zählrate wieder abfällt. Möglicherweise tritt ein zweites Maximum einer anderen Masse auf. Genau das beobachten wir hier. Die Zählrate fällt erneut ab, und schließlich tritt ein drittes Maximum auf.
Bei einer Analyse wählen wir den gewünschten Peak aus und stellen die Ablenkspannung so ein, dass nur dieser Peak den Detektor passiert. Ist dies nicht korrekt eingestellt, sind alle erfassten Daten praktisch wertlos.
Bei vielen dieser Elemente, wie beispielsweise ¹⁵N und ¹³C, das wir häufig verwenden, kennen wir das Aussehen der Spektren. Bei Selen hingegen war es eine echte Herausforderung, die Spektren eindeutig zuzuordnen und sicherzustellen, dass es sich tatsächlich um Selen handelte, insbesondere aufgrund der geringen Zählrate.
Als ich mir das genauer ansah und den Functional Data Explorer genauer betrachtete, fiel mir bei der Diskussion über die Verwendung von Wavelets sofort auf, dass diese Spektren fast identisch mit Haar-Wavelets aussehen. Außerdem ist praktisch kein Hintergrund vorhanden, da wir die Schwellenwerte und die Verstärkung der Detektoren so eingestellt haben, dass praktisch kein elektronischer Hintergrund auftritt und die Antwort gleich bleibt.
Wir müssen das tun, weil wir zwar ständig Isotopenverhältnisse messen, aber dafür zwei verschiedene Detektoren verwenden. Wenn diese beiden Detektoren nicht präzise aufeinander kalibriert sind, wird unsere Fähigkeit, ein korrektes Isotopenverhältnis zu messen, beeinträchtigt.
Im Prinzip müssen wir nur die Position eines dieser Signale und seine Zuordnung kennen. In diesem Fall weiß ich, dass dieser breite Peak ¹²C und ¹⁴N entspricht. Dieser hier ist Teil der ¹²C-, ¹³C- und ¹H-Komponente. Die Summe beider Werte beträgt 26.
Wenn wir die Größe des einen Stoffes kennen, können wir die Größe des anderen allein anhand der Massendifferenz bestimmen. Der Maßstab spielt keine Rolle, da wir immer nur die Massendifferenzen betrachten. Wir könnten das System zwar jederzeit präzise kalibrieren, aber das wäre extrem aufwendig und zeitintensiv.
Wenn wir den Wert eines Peaks kennen, können wir die anderen Peaks und ihre Differenzen berechnen und sie dann mit einem vorhandenen Programm verknüpfen. Im Prinzip können wir alle Elemente eingeben, die unserer Meinung nach in der Probe enthalten sind, und das Programm liefert alle möglichen Ergebnisse, die zusammen diese Masse ergeben, sowie die zugehörige Differenz zu diesem Peak.
Wenn wir FDE verwenden könnten, um all diese Effekte wie bei einer Dekonvolution zu trennen, wäre das ein enormer Vorteil für uns, insbesondere bei den schwereren Massen, wo mehr Interferenzen auftreten und die Trennung deutlich schwieriger ist. Das ist im Grunde alles, was ich dazu im Moment sagen kann. Bis zum Treffen werde ich hoffentlich viel mehr dazu wissen und vielleicht auch einige Beispiele präsentieren können.
Doch zunächst möchte ich einigen Kollegen danken: Dr. David Dent von der Sustainable Nitrogen Foundation sowie Professor Erik Murchie und Professor Ted Cocking von der Universität Nottingham. Sie spielten eine wichtige Rolle in der ersten Fallstudie zur Stickstofffixierung durch GD-Bakterien. Mein Dank gilt auch Dr. Diane Handy und Professor Claude Lechene von der Harvard Medical School. Sie waren ebenfalls maßgeblich an der Selenoprotein-Studie beteiligt, und natürlich allen meinen Kollegen am NiCE-MSI des NPL.
Mit Bedauern muss ich mitteilen, dass Ted und Claude inzwischen verstorben sind. Ihr Tod ist ein großer Verlust für die Wissenschaft, doch ihr Andenken wird durch diesen und viele weitere Vorträge bewahrt. Vielen Dank, und bei Fragen stehe ich Ihnen gerne zur Verfügung.
