Lors du sommet malheureux de 2020 à Munich, qui a démontré l'incroyable capacité d'adaptation des organisateurs du JMP Summit, nous avons présenté nos premières applications de JMP à l'analyse d'images de spectrométrie de masse à haute résolution spatiale (NanoSIMS).
Dans cet exposé, nous faisons le point sur nos avancées depuis la présentation précédente. Après un bref rappel de nos procédures analytiques fondamentales utilisant la liaison dynamique et Graph Builder, nous abordons des analyses plus avancées, notamment l'analyse de clusters, et enfin, les applications de JMP Pro Functional Data Explorer, en démontrant son utilité pour l'interprétation des spectres de masse.
Grâce au générateur de flux de travail récemment intégré à JMP 17, nous pouvons désormais réaliser ces analyses beaucoup plus rapidement. Nous nous appuyons sur des exemples de jeux de données issus de la recherche sur le cancer (tissus tumoraux) et de l'amélioration de la qualité des sols par l'utilisation de bactéries. Pour chacune de ces études, nous commençons par un bref rappel de son importance, puis la majeure partie de la présentation consiste en une démonstration en direct des étapes suivies pour parvenir au résultat final.
Bonjour à tous. Je m'appelle Greg McMahon et je suis chercheur principal au Laboratoire national de physique de Teddington, au Royaume-Uni. Je vais vous parler aujourd'hui des progrès réalisés dans l'utilisation de JMP et JMP Pro pour l'analyse d'images de spectrométrie de masse à haute résolution spatiale.
Cette intervention fait suite à celle que j'ai présentée il y a environ quatre ans lors de cette réunion de Munich qui, malheureusement, n'a pas pu se tenir. La pandémie de COVID-19 avait contraint l'organisation à se dérouler en ligne en un temps record. La capacité de ceux qui ont su s'adapter rapidement et faire de cette réunion en ligne un véritable succès reste impressionnante. Je suis ravi d'être parmi vous aujourd'hui, en personne et en ligne, et j'ai hâte de présenter mon intervention et d'échanger avec vous tout au long de la semaine.
Pour commencer, je vais vous parler du NanoSIMS, notre méthode d'imagerie par spectrométrie de masse à haute résolution spatiale. Vous trouverez une image de l'instrument ici, à gauche. Il n'en existe qu'une cinquantaine dans le monde. Ils sont utilisés pour diverses applications. Dans notre cas, environ 80 % sont liées à la biologie et environ 20 % aux sciences physiques, à la métallurgie, à la science des matériaux et aux semi-conducteurs.
En résumé, comment fonctionne l'instrument ? On génère un faisceau d'ions, qu'on accélère et qu'on focalise sur l'échantillon à analyser. Lorsque ce faisceau d'ions frappe l'échantillon, l'énergie qu'il lui communique provoque l'éjection d'atomes et de molécules de sa surface. Au cours de ce processus, une petite fraction de ces espèces éjectées est ionisée.
Une fois ionisés et chargés électriquement par l'application de champs électrostatiques intenses, nous pouvons les collecter et les focaliser dans ce que nous appelons la colonne secondaire, puis les diriger vers un aimant. Nous utilisons un spectromètre de masse à secteur magnétique. Ce dernier sépare les ions selon leur rapport masse/charge, d'une manière très similaire à la façon dont un prisme décompose la lumière en ses différentes longueurs d'onde.
Une fois la séparation effectuée, nous obtenons ce que nous appelons une chambre de collecte multiple, qui abrite sept détecteurs. Six de ces détecteurs sont montés sur des chariots motorisés, ce qui nous permet de les positionner à volonté. Le septième détecteur est fixe, au point le plus éloigné du centre de l'aimant. Généralement, l'échantillon le plus lourd est placé sur ce détecteur fixe, et les six autres sont positionnés en conséquence.
Devant chaque détecteur, nous acquérons un spectre de masse à haute résolution, visible ici. Il présente généralement plusieurs pics caractéristiques d'interférences de masse. J'y reviendrai plus en détail vers la fin de mon exposé. Pour résumer, les principaux avantages de cette méthode sont indiqués en bas de cette diapositive. Nous obtenons une résolution spatiale extrêmement élevée, pouvant atteindre environ 35 nanomètres. Une résolution de 100 nanomètres est assez courante et relativement simple à obtenir.
Nous obtenons également une haute résolution en masse, avec un rapport m/Δm d'environ 15 000 à 20 000. Ceci nous permet de séparer les pics, comme ceux que vous observez dans les spectres de masse présentés ici. Grâce à cette technique de spectrométrie de masse (ou SIMS), que nous appelons spectrométrie de masse d'ions secondaires, nous atteignons une très haute sensibilité, jusqu'à des concentrations de l'ordre du ppm et du ppb.
Je vais vous parler aujourd'hui de deux études de cas illustrant nos progrès. La dernière fois, j'ai abordé son application à la recherche sur le cancer. Je n'en parlerai pas aujourd'hui. Mon premier exemple sera assez simple : comment nous avons intégré le générateur de flux de travail à notre processus. Ce fut une véritable aubaine.
La première étude de cas que je vais aborder concerne les engrais azotés utilisés pour favoriser la croissance des plantes et leur impact sur le changement climatique. À l'échelle mondiale, c'est la disponibilité de l'azote fixé qui limite la production agricole. Malheureusement, on recourt souvent à des engrais azotés de synthèse qui, lors de leur production, peuvent polluer l'atmosphère par l'ammoniac et l'oxyde nitreux. Ils peuvent également être à l'origine de smog et d'autres polluants. Une fois épandus, ils peuvent entraîner l'acidification des écosystèmes et la nitrification des cours d'eau, et sont globalement néfastes pour le climat.
Il y a une trentaine ou une quarantaine d'années, on a découvert que certaines bactéries possèdent l'incroyable capacité de fixer l'azote inerte de l'atmosphère, le N₂, et de le transformer en ammoniac. Ce dernier est ensuite libéré dans la plante pour la synthèse des acides aminés, de la chlorophylle et des protéines. En pratique, cette capacité peut remplacer les engrais azotés de synthèse nocifs dont nous parlions précédemment.
Cependant, personne n'avait encore démontré ce phénomène à l'échelle micrométrique ou nanométrique chez les plantes. De nombreuses analyses globales l'ont mis en évidence, mais nous souhaitions l'étudier de manière beaucoup plus détaillée, avec une résolution spatiale bien supérieure.
Cette démonstration va illustrer comment nous avons prélevé des feuilles d'une plante, en l'occurrence du maïs, cultivée dans une atmosphère enrichie en ¹⁵N, sans aucun autre engrais de synthèse. Il n'existe aucune autre source possible d'¹⁵N. Un petit rappel s'impose : l'¹⁵N est un isotope lourd de l'azote. Sa concentration naturelle est d'environ 0,0037 %. Nous cultivons donc cette plante dans un environnement presque exclusivement composé d'¹⁵N (à 100 %) au lieu de 0,0037 % d'azote. L'objectif est d'utiliser la spectrométrie de masse pour détecter la présence d'¹⁵N dans la plante.
Je pense qu'à ce stade, je vais résumer notre première analyse et comment nous avons utilisé JMP Workflow Builder pour y parvenir. Nos fichiers de données brutes sont en réalité assez simples. Il s'agit d'un fichier CSV comportant deux colonnes définissant l'emplacement des pixels, et sept colonnes environ contenant les comptages des différentes masses mesurées.
Généralement, la première chose à faire, lorsqu'on analyse des rapports isotopiques, est de prendre les deux masses qui composent le rapport et d'insérer une nouvelle colonne pour la valeur du rapport isotopique. On peut ensuite utiliser Graph Builder pour reconstruire les images ioniques, comme celle-ci. Cette image-ci représente le carbone et l'azote d'une partie de la plante. On distingue différents organites. Ici, il s'agit d'un noyau. Et là, ce sont des chloroplastes.
Cette image représente le rapport isotopique de l'azote, avec une échelle de couleurs. Le bleu le plus foncé correspond au rapport naturel, celui que l'on attendrait pour l'azote ordinaire. Les nuances au-dessus indiquent des rapports élevés en ¹⁵N qui, dans ce cas précis, ne peuvent provenir que du gaz ¹⁵N₂ dans lequel ces plantes ont été cultivées.
Il est désormais clair que nous avons la preuve que les bactéries, les semences ont été inoculées avec ces bactéries, qu'elles ont rempli leur rôle : elles fixent l'azote et le répartissent dans toute la plante. Mais nous pourrions aussi générer… Il est très utile d'examiner la distribution des différents comptages, en particulier d'identifier les valeurs aberrantes.
J'ai chronométré le processus comme avant, c'est-à-dire en effectuant toutes ces étapes manuellement. Il me fallait environ 3 minutes pour arriver au résultat affiché à l'écran. Désormais, grâce à Workflow Builder, cela ne prend que 5 secondes environ. Si l'on traite une vingtaine de fichiers de ce type par jour, cela représente un gain de temps considérable, jusqu'à 45 minutes à une heure par jour. Sur un mois et une année, le gain est significatif.
Je vais vous faire une petite démonstration pour vous montrer à quoi cela ressemble. Ouvrons un fichier récent, je vais prendre celui-ci. Comme je l'ai dit, voici à quoi ressemble le fichier brut. Deux colonnes, X et Y. Elles contiennent les positions des pixels et leur nombre dans chaque zone.
Maintenant, je vais dans Fichier, Ouvrir récent, puis Partie 1, Générateur de flux de travail. Voilà notre Générateur de flux de travail. Je vais peut-être le réduire un peu. Exécutons-le étape par étape. Une nouvelle colonne est insérée. On lui donne le titre « Rapport isotopique de l'azote ». Une formule est appliquée, c'est-à-dire que le rapport est calculé. Voici notre image CN brute. C'était la première image que je vous ai montrée, sauf que là, elle est en couleur sur la diapositive. Elle était en niveaux de gris.
Voici l'image du rapport isotopique de l'azote. Nous pouvons terminer par les distributions, puis par des statistiques multivariées simples avec la matrice de nuages de points et la carte thermique. Nous avons constaté que les rapports étaient plus élevés dans ces organites particuliers. Il s'agit des chloroplastes. Les chloroplastes sont des organites responsables de la photosynthèse.
Le fait que l'azote semble se diriger préférentiellement vers les chloroplastes représente presque un double avantage, car il favorise ainsi leur croissance et leur fonctionnement. Or, les chloroplastes sont les organites qui captent le CO₂ atmosphérique et le convertissent en énergie pour stimuler la croissance des plantes. Du point de vue de la lutte contre le changement climatique, c'est donc une situation gagnant-gagnant. Nous réduisons le besoin d'azote de synthèse dans nos sols et, en plus, nous contribuons peut-être à absorber le CO₂ atmosphérique.
Mais tant que j'y suis, je vais faire une dernière chose. Ce qui était intéressant, c'était ces valeurs aberrantes élevées dans le signal du soufre. Nous allons les sélectionner. Comme vous le voyez, les valeurs sélectionnées sont devenues roses. Elles se produisent principalement dans les chloroplastes, à des degrés divers. La raison de cette différence reste incertaine ; il pourrait s'agir d'un effet temporel.
Mais ceci est important, car pour que cette réaction de fixation de l'azote ait lieu, elle nécessite l'intervention d'une enzyme riche en soufre. Ce fut un atout supplémentaire pour l'analyse de cet échantillon particulier.
Il s'agit d'une simple analyse préliminaire réalisée avec Workflow Builder. Cet outil permet un gain de temps considérable. Je vais maintenant fermer toutes les fenêtres, y compris cette analyse, puis retourner à la présentation PowerPoint et passer à la diapositive suivante. Cette partie illustre comment le soufre pénètre préférentiellement dans le chloroplaste, favorisant ainsi la fixation de l'azote.
C'était en fait une analyse assez simple, mais il nous arrive d'en recevoir d'autres qui sont beaucoup plus complexes. Le deuxième exemple que je vais utiliser est une étude que nous avons menée sur les sélénoprotéines. Si vous allez dans un magasin de produits diététiques, vous avez probablement déjà vu un rayon où sont vendus ces compléments alimentaires à base de sélénium.
C'est un domaine fascinant, encore à ses débuts. On en sait beaucoup, mais on ignore encore beaucoup de choses sur le fonctionnement des sélénoprotéines dans l'organisme. Certaines affirmations, étayées par des preuves, suggèrent qu'elles pourraient protéger le cerveau et renforcer le système immunitaire. Elles pourraient également avoir des propriétés antioxydantes, favoriser la reproduction, soutenir le fonctionnement de la glande thyroïde et exercer des effets antimutagènes, contribuant ainsi à prévenir les dommages à l'ADN.
La question précise que nous souhaitions aborder dans cette étude était la suivante : les sélénoprotéines s’associent-elles réellement à l’ADN pour contribuer à protéger son intégrité ? Rappelons que nous utilisons l’imagerie par spectrométrie de masse à très haute résolution spatiale, une technique parmi les rares capables d’établir ce lien avec une efficacité raisonnable.
Le problème avec les sélénoprotéines, c'est qu'elles sont déjà présentes en très faible quantité dans l'organisme. Pour simplifier, certains pourraient dire : « On va juste en ajouter un peu plus », mais il ne faut surtout pas le faire, car un excès de sélénium peut entraîner une intoxication. Étudier des échantillons en boîte de Petri auxquels on a ajouté artificiellement une quantité excessive de sélénium n'est pas très instructif.
Nous avons utilisé des précurseurs de sélénium, ingrédients typiques des compléments alimentaires, dans nos milieux de culture. Nous y avons ajouté 300 nanomoles de ces précurseurs marqués isotopiquement pour les sélénoprotéines : 76-méthylsélénocystéine enrichie en sélénium, 77-sélénométhionine enrichie en sélénium ou 82-sélénite de sodium.
Je tiens à préciser que, lorsque je parle d'isotopes, il s'agit d'isotopes stables. Ils ne sont ni radioactifs ni quoi que ce soit de ce genre. Ils sont parfaitement sûrs.
Nous avons ajouté ces composés au milieu de culture, ainsi que de la thymidine ¹⁵N. Il s'agit de notre allié, l'isotope lourd de l'azote ¹⁵N. Cet acide aminé marquera sélectivement l'ADN. Dans cette expérience de double marquage, nous espérons observer une corrélation entre les concentrations élevées d'azote et de sélénium, ou inversement, ou peut-être aucune corrélation du tout.
Si l'on observe les premières images acquises (celles obtenues avec notre logiciel Work Builder), on constate de très faibles concentrations de sélénium. Ce résultat n'est probablement pas surprenant, car, rappelons-le, le sélénium est peu abondant, même après un comptage aussi long. L'image de gauche représente le ratio de sélénium.
L'acquisition d'images a probablement duré un jour et demi à deux jours, consistant à collecter les données de l'échantillon pendant son balayage par le faisceau d'ions primaire. Sur l'image de rapport, les zones grises révèlent des données manquantes. Il y a probablement une quantité importante d'informations difficiles à visualiser.
On distingue essentiellement deux cellules sur cette image. Il s'agit de l'image carbone-azote, qui analyse la biomasse des cellules. Le reste, toute cette matière noire entre les cellules, est constitué de la résine d'enrobage. Ces échantillons sont inclus dans une résine polymère puis coupés en tranches très fines à l'aide d'un couteau diamant. On observe de faibles comptages.
Avant même d'aller plus loin, on s'est dit : « Il serait peut-être préférable de privilégier le nombre de points en regroupant les pixels dans l'image plutôt que la résolution spatiale. » Je me rends compte que je suis en train de transformer JMP en logiciel d'analyse d'images, ce qui n'était absolument pas prévu. Mais cette interconnexion dynamique est vraiment intéressante. L'association des deux est tout simplement superbe.
Je vais donc revenir en arrière et fermer cette fenêtre. Je tiens à remercier Julian Paris pour cela. L'année dernière, nous discutions à l'heure du déjeuner de la façon de gérer les images à la corbeille. Je vais brièvement revenir sur ce point. Nous avons intégré cette fonctionnalité au générateur de flux de travail. Permettez-moi de récupérer cette image.
Voici les données brutes. Le découpage en classes se fait en deux étapes. Je ne calculerai pas les rapports isotopiques ici. Nous allons sélectionner les colonnes X et Y, puis accéder à l'onglet « Utilitaires » et créer une formule de découpage. Ensuite, je vais dans « Points de coupure » et je vais découper les données en classes de largeur égale (4x4).
Je vais créer des intervalles égaux. Un décalage nul convient. Je passe à quatre, je clique sur OK, et je définis toutes les valeurs de X, puis je crée des colonnes de formule. Voilà, nous avons deux colonnes supplémentaires : X et Y. Je vais dans « Tableaux », puis dans un tableau récapitulatif, et je souhaite également ajuster toutes les colonnes de comptage ; je vais donc toutes les sélectionner.
Dans la section Statistiques, je souhaite additionner toutes les données. Je vais donc additionner le nombre d'occurrences de chaque pixel dans un seul carré de 4x4. L'étape suivante, moins évidente, consiste à regrouper les pixels par X et Y. Voilà. Nous avons maintenant notre image regroupée, que nous pouvons afficher dans l'éditeur de graphiques. Cliquez sur Graphique, puis sur X et Y. Colorions pour l'instant avec notre code couleur. Comme les pixels sont regroupés, agrandissons légèrement la taille des marqueurs.
Nous avons maintenant quatre décomptes supplémentaires. L'échelle des axes est un peu chargée. Quoi qu'il en soit, je pensais qu'il était utile de le montrer, au cas où d'autres personnes utiliseraient cette technique avec leurs images, car ce n'était pas si évident au départ. Je vais fermer cette fenêtre et retourner à PowerPoint.
Une fois l'image triée, nous avons calculé les rapports isotopiques de l'azote et du sélénium. Nous avons obtenu toutes nos distributions et notre carte thermique. En examinant cette dernière, quelque chose nous a paru étrange. Le rapport isotopique du sélénium semblait présenter une corrélation négative avec le sélénium 77 et le sélénium 80. Nous avions une corrélation négative aussi bien avec le numérateur qu'avec le dénominateur, ce qui nous paraissait anormal. On s'attendrait à une corrélation positive, mais non.
Nous avons commencé à nous interroger. Ce qui nous intriguait vraiment, c'était toutes ces valeurs aberrantes concernant le rapport isotopique du sélénium et sa distribution. Nous observons également de nombreuses valeurs aberrantes pour le rapport isotopique de l'azote. Mais cela nous inquiète moins, car nous savons que le taux de comptage est plus élevé. En fait, par simple expérience, nous savons que nous pouvons atteindre ce niveau de rapport isotopique grâce à l'administration de thymidine marquée à l'azote 15 (¹⁵N), et particulièrement à des concentrations micromolaires. Mais pour ce point précis, nous n'étions pas certains. Nous étions en terrain inconnu.
Nous avons alors décidé d'examiner de plus près ces valeurs aberrantes. Nous avons effectué une analyse robuste des valeurs aberrantes et nous avons constaté que la plupart d'entre elles avaient effectivement été identifiées comme telles par l'algorithme d'ajustement robuste.
Une fois ces éléments supprimés et la carte thermique et la matrice de nuages de points recalculées, les choses semblent plus claires. Le sélénium 77 présentait une très faible corrélation positive et le sélénium 80 une corrélation légèrement négative¹ pour le ratio. C'est plus logique.
À ce moment-là, nous nous sommes dit : « Essayons une analyse de regroupement simple. » C’est ce que nous avons fait. Nous avons utilisé l’algorithme des k-moyennes, en nous concentrant sur trois variables. Très simple : le phosphore, le rapport isotopique du sélénium et le rapport isotopique de l’azote.
Ce que nous espérons trouver, ou du moins selon notre hypothèse, c'est un groupe où l'on observe à la fois des taux élevés de sélénium et d'azote, dans le cas où les sélénoprotéines s'associent effectivement à l'ADN pour contribuer à le protéger contre certains dommages à l'ADN.
Mais en comparant les graphiques parallèles, on ne constate jamais cela. L'un est toujours supérieur à l'autre, ou inversement, ou bien les valeurs sont à peu près identiques, mais faibles. Ce fut notre premier indice que notre méthode ne fonctionnait peut-être pas, ou que notre hypothèse était erronée.
En analysant ces valeurs aberrantes du rapport isotopique du sélénium, nous avons constaté qu'elles étaient toutes associées à des concentrations extrêmement faibles de sélénium 80. En réalité, la concentration devrait se situer ici, à 77. De fait, ces valeurs étaient toutes incluses dans la matrice ou la résine d'enrobage.
Cela nous a amenés à penser : « Il faut aller plus loin, car toute cette résine d'inclusion biaise notre analyse. Il faut s'en débarrasser. » C'est facile. On peut simplement effectuer une autre analyse de regroupement rapide, en utilisant principalement le nombre de copies (CN) et quelques autres paramètres, et créer deux groupes. Grâce aux valeurs élevées de CN, il sera évident que nous pouvons segmenter le tout et ne conserver que les cellules restantes. Nous pouvons ensuite créer un sous-ensemble de données à partir de là et obtenir un nouveau tableau de données exploitable.
C'est ce qui nous donne cette matrice de nuages de points et cette carte thermique, où nous examinons maintenant le rapport isotopique du sélénium. Nous observons une corrélation négative à 80 ; à 77, la corrélation positive est beaucoup plus forte. Tout cela est désormais clair. Mais ce qui nous intéresse vraiment, c'est le rapport isotopique du sélénium et celui de l'azote, qui présentent maintenant une corrélation négative parfaite. Cela signifie que ce que nous pensions être la réalité était erroné. Pour étudier d'autres domaines, nous devrions examiner des centaines de ces cellules.
Nous disposons désormais de notre générateur de flux de travail complet, qui intègre un découpage de l'image en blocs de 4x4 à l'aide de trois générateurs de graphiques (un pour chaque masse), du CN, du rapport isotopique du sélénium, du rapport isotopique de l'azote, des distributions, des statistiques multivariées (calculées une première fois), d'une analyse des valeurs aberrantes, du clustering K-Means et des graphiques de coordonnées parallèles. Le clustering K-Means permet de segmenter les cellules.
Le nouveau tableau de données est créé avec Graph Builder. Nous pouvons ensuite procéder à des analyses statistiques multivariées. À ce stade, nous avons terminé. Nous avons également ajouté un clustering K-means et un graphique parallèle.
Je vais vous montrer comment ça marche, c'est plutôt amusant. On va dans Fichier, Ouvrir récent, et voilà le fichier. Maintenant, on va dans Ouvrir récent avec le Générateur de flux de travail. C'est la deuxième partie. On va le lancer et regarder le processus en temps réel.
Voici le premier ensemble d'images, le deuxième, le troisième, les distributions, la matrice de nuages de points, l'analyse des valeurs aberrantes. Ensuite, le nuage de points, le clustering K-Means, l'image du sous-ensemble de données. Enfin, la dernière matrice de nuages de points. Nous pouvons exécuter tout cela maintenant en faisant simplement glisser le bouton droit sur le fichier d'ouverture. Cela permet également un gain de temps considérable.
C'est pratique, car je peux développer ces outils, les envoyer à ma collègue, et ensuite, lorsqu'elle consulte les données, elle n'a plus besoin de faire tout ça. Elle n'a qu'à cliquer sur « Lancer », et tout est là. On va tout fermer.
Une dernière chose. Nous sommes en janvier, mais en mars… En fait, c'est l'avant-dernière chose. Oui, j'avais oublié. Après avoir terminé tout cela, nous avons effectué un clustering K-means supplémentaire sur ce sous-ensemble de données. Encore une fois, comme le montrent les graphiques parallèles, il n'y a absolument aucun signe de forte concentration en sélénium ou en azote parmi tous les clusters.
Je ferais au minimum trois groupes de 10 clusters et au maximum trois, puis je retiendrais celui qui serait identifié comme le meilleur selon le critère CCC. Mais dans tous les cas, on ne constate aucune forte concentration de sélénium ni d'azote.
Notre conclusion est que, du moins directement, rien ne prouve que ces sélénoprotéines protègent l'ADN par simple association spatiale. Un mécanisme indirect reste possible, mais il dépasse largement le cadre de notre étude.
Enfin, comme je l'ai dit, nous ne sommes qu'à la fin du mois de janvier. J'espère pouvoir en dire plus d'ici mars. Mais voici comment je pense que nous pouvons utiliser Functional Data Explorer pour nous aider dans un autre type d'analyse dont nous avons besoin.
Je vous ai montré dès le début ces spectres à haute résolution de masse acquis par chaque détecteur. Nous les acquérons car, lors du réglage du détecteur, nous devons connaître la masse que nous analysons précisément, en raison des nombreuses interférences de masse présentes dans de nombreux cas.
Ce qui se passe, c'est que j'ai agrandi cette zone côté détecteur : le faisceau d'ions séparé traverse une série de plaques de déviation qui balayent le faisceau d'ions secondaires focalisé à travers une fente étroite, puis pénètrent dans le détecteur. Le diamètre de ce faisceau est inférieur à la largeur de cette fente. Vous pouvez observer ce qui se produit lorsque la déviation est importante : le faisceau n'atteint pas le détecteur ; il frappe plutôt le bord de la fente.
Le trajet dévié le dévie davantage, et il commence à pénétrer dans la fente et à se diriger vers le détecteur, ce qui fait augmenter le nombre de coups. À un certain point, il est entièrement à l'intérieur de la fente, et on observe alors un pic bien plat, puis le signal commence à diminuer. Un deuxième pic, provenant d'une autre masse, peut apparaître. C'est ce que nous observons ici. Le signal diminue à nouveau, puis on observe un troisième pic.
Lors d'une analyse, nous sélectionnons le pic à surveiller et réglons la tension de déflexion de façon à ce que seul ce pic soit détecté. Un mauvais réglage rend toutes les données acquises inutilisables.
Pour beaucoup de ces éléments, comme le ¹⁵N et le ¹³C que nous utilisons fréquemment, nous connaissons l'allure de leurs spectres. Mais pour le sélénium, il a été particulièrement difficile de s'assurer qu'il s'agissait bien de sélénium, surtout compte tenu du très faible taux de comptage.
Mais lorsque j'ai examiné ces données, et que j'ai commencé à explorer Functional Data Explorer, la première chose qui m'a frappé lors de notre discussion sur l'utilisation des ondelettes, c'est que ces spectres ressemblent presque trait pour trait aux ondelettes de Haar. De plus, le bruit de fond est quasi inexistant, car nous avons paramétré les seuils et les gains des détecteurs de manière à éliminer tout bruit électronique parasite et à garantir une réponse uniforme.
Nous devons procéder ainsi car nous mesurons constamment les rapports isotopiques, mais à l'aide de deux détecteurs différents. Si ces deux détecteurs ne sont pas étalonnés l'un par rapport à l'autre avec précision, notre capacité à mesurer un rapport isotopique correct s'en trouve diminuée.
En résumé, il nous suffit de connaître la position de l'un de ces éléments et son attribution. Ici, je sais que ce large pic correspond à ¹²C et ¹⁴N. Celui-ci fait partie du pic ¹²C, ¹³C, ¹H. La somme de ces deux pics est égale à 26.
Si l'on connaît la masse d'un élément, on peut déterminer celle de l'autre par simple différence. L'échelle importe peu, car on s'intéresse toujours aux différences de masse. On pourrait calibrer ce système avec une précision constante, mais cela exigerait un travail considérable.
Si nous connaissons la valeur d'un pic, nous pouvons calculer les valeurs des autres pics, les différences, puis les relier à un programme existant. En résumé, nous pouvons y intégrer tous les éléments que nous pensons présents dans l'échantillon, et le programme générera tous les résultats possibles correspondant à cette valeur, ainsi que la différence associée à ce pic particulier.
Si nous pouvions utiliser l'équation différentielle floue (EDF) pour séparer tous ces éléments, comme avec une déconvolution, ce serait un atout considérable, notamment pour les masses plus importantes où les interférences sont plus nombreuses et bien plus difficiles à éliminer. C'est à peu près tout ce que j'avais à dire pour le moment. Mais d'ici la réunion, j'espère avoir beaucoup plus d'informations et peut-être quelques exemples.
Mais pour l'instant, je tiens simplement à remercier quelques collègues : le Dr David Dent, de la Sustainable Nitrogen Foundation, ainsi que les professeurs Erik Murchie et Ted Cocking, de l'Université de Nottingham. Leur contribution a été essentielle à la première étude de cas sur la fixation de l'azote par les bactéries GD. Je remercie également le Dr Diane Handy et le professeur Claude Lechene, de la Harvard Medical School. Leur travail a été indispensable à l'étude sur les sélénoprotéines, ainsi que tous mes collègues du NiCE-MSI au NPL.
C'est avec une profonde tristesse que je vous annonce le décès de Ted et Claude. Leur disparition est une immense perte pour la communauté scientifique, mais leur mémoire perdurera grâce à cette conférence et à bien d'autres à venir. Merci beaucoup, et si vous avez des questions, je me ferai un plaisir d'y répondre.
