Hola a todos, mi nombre es Ben y recientemente me uní a JMP como pasante enfocándome en el desarrollo de contenido para la plataforma Functional Data Explorer que está disponible en JMP Pro 17 (puede leer más sobre mí aquí ). Actualmente estoy estudiando mi doctorado en Ingeniería Química en la Universidad de Manchester con especialización en la producción de biosurfactantes soforolípidos. Esto me ha dado mucha información sobre los datos/necesidades potenciales para procesar datos en las primeras etapas del desarrollo de bioproductos. El estudio de caso aquí describe mi trabajo en el desarrollo de un método analítico para detectar correctamente biosurfactantes soforolípidos, utilizando análisis de datos funcionales y DoE funcional para guiar mi protocolo experimental.
¿Qué te gusta de este estudio de caso?
- Utiliza análisis de datos funcionales y FDoE; puede mostrar los dos componentes principales de la herramienta Functional Data Explorer.
- El conjunto de datos es real y se basa en trabajos de desarrollo reales.
- Puede mostrar imágenes muy atractivas: factor "sorpresa".
- Puede utilizar la plataforma FDE para realizar fácilmente un preprocesamiento (alineación, filtrado)
¿Para quién?
- Cualquier persona involucrada en el desarrollo analítico, incluidas las industrias química, biológica y farmacéutica.
- Cualquiera del departamento de I+D debería poder ver cómo se podría traducir esto en su situación.
¿Cómo debo usarlo?
- Puede usarlo para hacer una demostración de la herramienta Functional DoE en JMP Pro. La tabla de datos adjunta tiene guiones guardados para cada etapa del proceso o puede seguir los detalles del estudio de caso a continuación para recrear el trabajo.
- Puede usarlo para mostrar la capacidad de simplificar la presentación de datos en la plataforma Functional Data Explorer.
¿Qué plataformas podemos utilizar?
- Generador de gráficos
- Explorador de datos funcionales
Fondo
Los biosurfactantes soforolípidos se producen mediante la fermentación de una levadura con azúcar, aceite y nitrógeno que están compuestos por una cabeza hidrófila y una cola hidrófoba. Como ocurre con muchos bioproductos, existe una variación masiva en estas estructuras en una sola fermentación en términos de enlaces químicos, longitud de cadena y grupos funcionales (por nombrar algunos). Para los científicos analíticos, esto representa un desafío en términos de separar estos compuestos de manera eficiente cuando se utilizan herramientas analíticas como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
En este estudio de caso, me enfrenté al desafío de intentar producir un método capaz de cuantificar biosurfactantes soforolípidos con HPLC-UV, algo que no se había hecho anteriormente. Desafortunadamente, mi método inicial no pudo separar dos congéneres de soforolípidos (C18:1 y C17:1) de otro con HPLC. Solo se diferenciaban en un carbono, lo que significa que tenían absorbancia (la longitud de onda de la luz que absorben) y tiempo de retención (el tiempo que aparecen en un espectro de HPLC) similares. No pude hacer nada para cambiar la absorbancia, pero pude adaptar mi método de HPLC para cambiar el tiempo de retención de los dos productos para que se separaran mejor. La separación de picos es vital en análisis, ya que el área del pico se utiliza para calcular la concentración de un compuesto determinado; sin picos "independientes", este cálculo es inherentemente defectuoso y puede dar lugar a lecturas inexactas. El ejemplo descrito aquí representa un desafío común en análisis y tiene relevancia para una amplia variedad de grupos industriales y de investigación.
Objetivos
- Para optimizar la configuración de HPLC para separar eficazmente los picos C18:1 y C17:1
- Asegúrese de que los picos sean sensibles (sin pérdidas importantes en la altura del pico) y específicos (sin picos amplios)
Desarrollo de métodos: aplicación inicial del DoE
Para optimizar el método HPLC, apliqué un DoE simple que adaptó la temperatura (30, 35 y 40 o C) y el caudal (0,7 y 1,4 ml/min) del método. Se probó la misma concentración de muestra de soforolípidos en cada iteración y todas las demás condiciones se mantuvieron constantes en todo momento.
El resultado del HPLC es un cromatograma: mide la intensidad de la absorbancia a una longitud de onda (198 nm) a lo largo del tiempo, cada pico representa un compuesto que sale del HPLC y golpea el detector; cuanto más interactúa cada compuesto con la columna de HPLC, más tiempo dura. tarda en llegar al detector, provocando un tiempo de retención posterior. La mayoría de las muestras que se colocan en HPLC contienen cientos de compuestos (incluido el compuesto de interés) que producen un gráfico muy completo que hace imposible discernir a simple vista las diferencias específicas entre cada configuración.
Para complicar aún más las cosas, el cambio en la configuración (particularmente la tasa de flujo) significó que nuestro pico de interés (para las formas C18:1 y C17:1) no tenía el mismo tiempo de retención. Esto no sólo hace que sea difícil seleccionar el pico, sino que también hace que sea muy difícil producir un gráfico comparativo cuando se realizan numerosas ejecuciones sin que el gráfico se vuelva demasiado complicado.
Aplicación de la herramienta Functional Data Explorer y FDoE
Para explorar los cambios en el cromatograma se aplicó la herramienta Functional Data Explorer (Analizar > Modelado especializado > Functional Data Explorer). La configuración se aplicó como se indica arriba.
El conjunto de datos inicial mostró que todo el cromatograma está muy ocupado, mientras que la región de interés estaba en los picos C18:1 y C17:1 que ocurrieron entre 22 y 30 minutos. El rango de tiempo se redujo de 22 a 30 minutos usando la herramienta Comandos>Filtro X.
Para obtener algo significativo en la comparación, era necesario alinear los picos separados (que cambiaron debido al cambio en el caudal). Como los picos de interés tenían la mayor intensidad en el rango de interés (como suele ser el caso en HPLC para compuestos específicos), esto se hizo fácilmente con la herramienta Align>Align Maximum . Se utilizó otro Filtro X para reducir el rango solo al pico de interés (tiempo alineado de -1 a +1). La alineación de picos se utiliza mucho en análisis, particularmente en el desarrollo de procesos LC-MS y HPLC, y la facilidad de aplicarla con la herramienta FDE es muy útil para los científicos analíticos.
Ahora que los datos estaban listos para el análisis, se aplicó un modelo Wavelet (Desplegable > Modelos > Wavelets) ya que se ajustaba mejor a los datos cromatográficos. Para poder perfilar el efecto del cambio de temperatura y caudal, se utilizó Wavelet DoE (Desplegable > Análisis Wavelets DoE) para perfilar el cromatograma.
Al observar el cambio en el caudal (izquierda), el perfilador FDoE demuestra fácilmente cómo el cambio en el caudal provoca una agudización del pico (que se muestra por el aumento en el valor de intensidad del pico) y la aparición de un segundo pico (el C17: 1 compuesto). Además de esto, los cambios de temperatura (derecha) mejoraron aún más esta separación y agudización del pico. A partir de este perfilador, quedó claro que los picos se estaban separando, pero no lo suficiente ; esto indicó que se requerían más ejecuciones experimentales.
Carreras adicionales
A partir de la salida del perfilador DoE funcional Wavelet se realizaron 4 ejecuciones adicionales: 2 analizando el aumento de temperatura (45 y 50 o C) y 2 con mayor caudal y temperatura (45 o C, 1,6 y 1,8 ml/min). Los datos cromatográficos se agregaron al conjunto de datos anterior y se utilizó la herramienta Functional Data Explorer para producir un perfilador Wavelet DoE como se describe anteriormente.
El perfilador FDoE/Wavelet pudo demostrar que el caudal tenía rendimientos decrecientes para el HPLC: no mejoró mucho la separación de picos a caudales más altos y condujo a una disminución en la altura del pico (lo que significa una sensibilidad reducida). Como no hubo una mejora significativa en la separación, el caudal se mantuvo en 1,4 ml/min para sostener la columna (caudales más altos pueden ser perjudiciales para las HPLC, por lo que se pudo equilibrar el riesgo frente a la recompensa).
Al observar la temperatura, el perfilador pudo mostrar mejoras significativas tanto en la altura del pico (mejorando la sensibilidad) como en la separación del segundo pico.
¿Por qué esto importa?
Desde la perspectiva de los clientes, la necesidad de FDE y FDoE se puede explicar con una simple pregunta:
¿Preferirías intentar explicar las diferencias con esto?
¿O esto?
El uso de la plataforma FDE puede proporcionar importantes ahorros de tiempo, agilizar la producción de resultados y permitir conversaciones más sencillas con personas que no son PYME al discutir sus resultados. Cuando esto se coloca en tangente con FDoE, se obtiene una herramienta poderosa que puede identificar todo el cambio en los datos/perfiles funcionales, en lugar de usar puntos únicos (es decir, área máxima en un HPLC, tiempo de retención máximo). El estudio de caso aquí demuestra el uso de FDE para informar el desarrollo del método HPLC para producir un método optimizado.
Actualización (06 de enero del 22): Agregar una función de destino (base de datos actualizada)
Actualicé el modelo FDE para incluir una función de destino para el método HPLC. Esto se puede cargar en Procesamiento de datos > Funciones de destino. El objetivo apunta a tener picos completamente separados (con 0 intensidad en cada lado) que aún conserven un pico alto y afilado. Tenga en cuenta que el objetivo no tenía que escribirse con un eje x de 'tiempo alineado': todos los pasos de procesamiento también cambiarán el objetivo.
El generador de perfiles ahora contiene un botón "Optimizar objetivo" que encontrará las configuraciones de temperatura y caudal que logran el perfil más cercano al objetivo.
Actualizar(14Mar23): Cómo construir un objetivo
En el conjunto de datos adjunto 'Ejemplo de construcción de un objetivo - HPLC.jmp', tomé una curva de HPLC que está 'cerca' de lo que deseo pero que no ha alcanzado mis objetivos (separación completa de los picos, picos más nítidos). Puedo usar este conjunto de datos y seleccionar los puntos de datos que quiero cambiar. En el ejemplo yo:
1. Seleccionó los puntos de datos en el valle entre los dos picos y los cambió a cero.
2. Se eliminó la cantidad de puntos de datos en la punta de los picos para garantizar un pico "más nítido".
3. Se eliminaron los puntos de datos que subían y bajaban en cada pico.
Luego utilicé la herramienta spline y ajusté el valor lambda para obtener la mejor curva de ajuste para mis datos. Descubrí que esto realmente resuena entre los clientes, por lo que vale la pena mostrar cómo la lambda cambia la forma. Luego uso 'Guardar fórmula' para guardar los valores de las splines y luego los copio como destino en la base de datos.
Hola @Joseph_Reese , gracias por los comentarios, me alegra que te haya gustado el ejemplo.
- Estaré feliz de publicar esto como una publicación de blog para la comunidad en general, probablemente como un video corto para FDE.
- Supongo que cuando su cliente se refiere a reducir las impurezas, se refiere a separarlas en el cromatograma de sus picos de interés. En este caso les sugeriría que hicieran un proceso de dos pasos:
A) Ejecute sus DOE (u otros datos de lotes experimentales) según lo planeado e identifique las mejores configuraciones que tienen a través de su conjunto de datos real (esto puede ser informado por el perfilador de DOE)
Tomar ese perfil objetivo y ajustarlo según sus requerimientos. Adjunté un ejemplo en el artículo original de cómo junté las curvas objetivo aquí; en este ejemplo tomé una curva "buena" de mis carreras y la ajusté para asegurarme de que los picos tuvieran un espacio distinto entre cada uno (cero intensidad en cada lado) y ajustó el ancho de los picos en su punta. Puede utilizar la herramienta spline en Graph Builder para crear una fórmula suavizada que luego puede traer de vuelta a su tabla de datos original como objetivo (si cambia Lambda, puede obtener el ajuste que necesita).
- Para las curvas objetivo, en este momento todo se reduce a la manipulación manual; el método que describí anteriormente funciona bien, pero depende de la manipulación de los datos actuales. Un complemento para dibujar el gráfico que desees sería fantástico. Lo que les he dicho a los clientes es que el objetivo no siempre tiene que ser perfecto; en este caso, podría haber usado simplemente dos 'triángulos' toscos colocados uno al lado del otro para representar los picos; el modelo aún intentaría lo mejor que podía. para optimizar la configuración.
- A partir de los diferentes conjuntos de datos que he probado, el tipo de curvas vistas en los gráficos de diagnóstico FDOE es bastante normal; muchas veces los peores culpables son las configuraciones que están en el borde del diseño. En este ejemplo, los valores rojos están en el borde de mi diseño y no están contenidos dentro de un espacio de diseño "uniforme". Más réplicas ayudarían a mejorar esto también.
Hola @Bingh94 , ¡Gracias por este excelente post! Es muy oportuno para mí ya que me acaban de preguntar cómo se podría utilizar FDE para minimizar las impurezas en los ensayos de HPLC. Tuve algunas preguntas y comentarios mientras leía esto y agradecería cualquier comentario.
- ¿Puede ser esta una publicación de blog propia o una breve demostración en video? Esto se lee como algo que ya es apto para una audiencia externa y cuantos más ejemplos de FDE haya, mejor.
- En el ejemplo de mi cliente, si se concentrara en reducir las impurezas, ¿sería una curva objetivo el mejor camino a seguir? ¿O sería preferible utilizar el perfilador FDOE y la configuración de conveniencia para minimizar ciertos picos?
- En cuanto al tema de las curvas objetivo, ¿existe una manera fácil para que nuestros clientes creen curvas objetivo o la mayoría de las personas lo hacen manualmente al intentar escribir un conjunto de datos que se ajuste al perfil deseado?¿Está pensando en cómo tal vez un complemento podría ayudar a crear un conjunto de datos basado en dibujar en un gráfico o modificar de alguna manera las curvas existentes de manera similar a cómo interactuamos con las curvas de deseabilidad?
- Última pregunta... en su ejemplo, los gráficos de diagnóstico del FDOE muestran algunos patrones inusuales. ¿Qué tan preocupados deberíamos estar por eso? ¿Abordar esto implicaría adaptar modelos GenReg adicionales o sería esto una indicación de que necesitamos más datos?
¡Gracias una vez más por el gran trabajo aquí!
