Hola a todos, mi nombre es Ben y recientemente me uní a JMP como pasante y me enfoqué en desarrollar contenido para la plataforma Functional Data Explorer que está disponible en JMP Pro 17 (puedes leer más sobre mí aquí ). Actualmente estoy estudiando mi doctorado en Ingeniería Química en la Universidad de Manchester con un enfoque en la producción de biosurfactantes de soforolípidos. Esto me ha dado mucha información sobre los datos/necesidades potenciales para el procesamiento de datos en las primeras etapas de desarrollo de bioproductos. El estudio de caso aquí describe mi trabajo en el desarrollo de un método analítico para detectar correctamente los biosurfactantes de soforolípidos, utilizando análisis de datos funcionales y DoE funcional para guiar mi protocolo experimental.
¿Qué le gusta de este caso de estudio?
- Utiliza análisis de datos funcionales y FDoE: puede mostrar los dos componentes principales de la herramienta Explorador de datos funcionales
- El conjunto de datos es real y se basa en el trabajo de desarrollo real.
- Puede mostrar imágenes muy convincentes: factor "wow".
- Puede utilizar la plataforma FDE para realizar fácilmente el preprocesamiento (alineación, filtrado)
¿Para quién?
- Cualquier persona involucrada en el desarrollo analítico, incluidas las industrias química, biológica y farmacéutica.
- Cualquier persona de I+D debería poder ver cómo podría traducirse en su situación.
¿Cómo debo usarlo?
- Puede usarlo para hacer una demostración de la herramienta Functional DoE en JMP Pro. La tabla de datos adjunta tiene guiones guardados para cada etapa del proceso o puede seguir los detalles del estudio de caso a continuación para recrear el trabajo.
- Puede usarlo para mostrar la capacidad de simplificar la presentación de datos en la plataforma Functional Data Explorer.
¿Qué plataformas podemos usar?
- Generador de gráficos
- Explorador de datos funcionales
Fondo
Los biosurfactantes de soforolípidos se producen mediante la fermentación de una levadura con azúcar, aceite y nitrógeno que se componen de una cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica. Al igual que con muchos bioproductos, existe una gran variación en estas estructuras en una sola fermentación en términos de enlaces químicos, longitud de cadena y grupos funcionales (por nombrar algunos). Para los científicos analíticos, esto representa un desafío en términos de separar estos compuestos de manera eficiente al usar herramientas analíticas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
En este estudio de caso, me enfrenté al desafío de intentar producir un método capaz de cuantificar biosurfactantes de soforolípidos con HPLC-UV, algo que no se había hecho anteriormente. Desafortunadamente, mi método inicial no pudo separar dos congéneres de soforolípidos (C18:1 y C17:1) de otro con HPLC. Solo diferían en un carbono, lo que significa que tenían una absorbancia (la longitud de onda de la luz que absorben) y un tiempo de retención (el tiempo que aparecen en un espectro de HPLC) similares. No pude hacer nada para cambiar la absorbancia, pero pude adaptar mi método de HPLC para cambiar el tiempo de retención de los dos productos para que se separen mejor. La separación de picos es vital en el análisis, ya que el área del pico se usa para calcular la concentración de un compuesto dado; sin picos "independientes", este cálculo es inherentemente defectuoso y puede dar lugar a lecturas inexactas. El ejemplo descrito aquí representa un desafío común en análisis y tiene relevancia para una amplia variedad de grupos industriales y de investigación.
Objetivos
- Para optimizar la configuración de HPLC para separar de manera efectiva los picos C18:1 y C17:1
- Asegúrese de que los picos sean sensibles (sin pérdida importante en la altura del pico) y específicos (sin picos amplios)
Desarrollo de métodos: aplicación inicial del DoE
Para optimizar el método HPLC, apliqué un DoE simple que adaptaba la temperatura (30, 35 y 40 o C) y caudal (0,7 y 1,4 ml/min) del método. Se probó la misma concentración de muestra de soforolípido en cada iteración y todas las demás condiciones se mantuvieron constantes en todo momento.
El resultado de la HPLC es un cromatograma: mide la intensidad de la absorbancia a una longitud de onda (198 nm) a lo largo del tiempo, cada pico representa un compuesto que sale de la HPLC y golpea el detector: cuanto más tiempo interactúa cada compuesto con la columna de HPLC, más tiempo dura. tarda en llegar al detector, provocando un tiempo de retención posterior. La mayoría de las muestras que se someten a HPLC contienen cientos de compuestos (incluido su compuesto de interés) que producen una muy gráfico ocupado que hace que sea imposible discernir las diferencias específicas entre cada configuración a simple vista.
Para complicar aún más las cosas, el cambio en la configuración (en particular, la tasa de flujo) significó que nuestro pico de interés (para las formas C18:1 y C17:1) no tuviera el mismo tiempo de retención. Esto no solo hace que sea difícil elegir su pico, sino que también hace que sea muy difícil producir un gráfico de comparación cuando tiene numerosas ejecuciones sin que el gráfico se complique demasiado.
Aplicación de la herramienta Functional Data Explorer y FDoE
Para explorar los cambios en el cromatograma se aplicó la herramienta Explorador de datos funcionales (Analyze > Specialized Modeling > Functional Data Explorer). Los ajustes se aplicaron como se indica arriba.
El conjunto de datos inicial mostró todo el cromatograma que está muy ocupado, mientras que la región de interés estaba en los picos C18:1 y C17:1 que ocurrieron entre 22 y 30 minutos. El intervalo de tiempo se redujo de 22 a 30 minutos utilizando el Comandos>Filtro X herramienta.
Para obtener algo significativo en la comparación, era necesario alinear los picos separados (cambiados debido al cambio en el caudal). Como los picos de interés tenían la mayor intensidad en el rango de interés (como suele ser el caso en HPLC para compuestos específicos), esto se hizo fácilmente con el Alinear>Alinear máximo herramienta. Otro Filtro X se usó para reducir el rango solo al pico de interés (-1 a +1 tiempo alineado). La alineación de picos se usa mucho en análisis, particularmente en el desarrollo de procesos de LC-MS y HPLC, y la facilidad de aplicarla con la herramienta FDE es muy útil para los científicos analíticos.
Ahora que los datos estaban listos para el análisis, un modelo Wavelet (Desplegable > Modelos > Wavelets) se aplicó porque se ajustaba mejor a los datos cromatográficos. Para poder perfilar el efecto de cambiar la temperatura y el caudal, Wavelet DoE (Desplegable > Análisis Wavelets DoE) se utilizó para perfilar el cromatograma.
Al observar el cambio en la tasa de flujo (izquierda), el generador de perfiles FDoE demuestra fácilmente cómo el cambio en la tasa de flujo provoca una agudización del pico (mostrado por el aumento en el valor de la intensidad del pico) y la aparición de un segundo pico (el C17: 1 compuesto). Además de esto, los cambios de temperatura (derecha) mejoraron aún más esta separación y la agudización del pico. A partir de este perfilador, quedó claro que los picos se estaban separando pero no lo suficiente – esto indicó que se requerían más corridas experimentales.
más carreras
A partir de la salida del perfilador DoE funcional de Wavelet, se realizaron 4 ejecuciones adicionales: 2 para observar el aumento de la temperatura (45 y 50 o C) y 2 con mayor caudal y temperatura (45 o C, 1,6 y 1,8 ml/min). Los datos cromatográficos se agregaron al conjunto de datos anterior y la herramienta Explorador de datos funcionales se usó para producir un perfilador Wavelet DoE como se describe anteriormente.
El perfilador FDoE/Wavelet pudo demostrar que la tasa de flujo tenía rendimientos decrecientes para la HPLC: no mejoró mucho la separación de picos a tasas de flujo más altas y condujo a una disminución en la altura del pico (lo que significa una sensibilidad reducida). Como no hubo una mejora significativa en la separación, la velocidad de flujo se mantuvo en 1,4 ml/min para sostener la columna (las velocidades de flujo más altas pueden ser perjudiciales para las HPLC, por lo que esto pudo equilibrar el riesgo frente a la recompensa).
Al observar la temperatura, el perfilador pudo mostrar mejoras significativas tanto en la altura del pico (mejorando la sensibilidad) como en la separación del segundo pico.
¿Por qué importa esto?
Desde la perspectiva de los clientes, la necesidad de FDE y FDoE se puede explicar con una simple pregunta:
¿Preferirías tratar de explicar las diferencias con esto?
¿O esto?
El uso de la plataforma FDE puede proporcionar ahorros de tiempo significativos, agilizar la producción de resultados y permitir conversaciones más sencillas con personas que no son PYME al discutir sus resultados. Cuando esto se coloca en tangente con FDoE, obtiene una poderosa herramienta que puede identificar todo el cambio en datos/perfiles funcionales, en lugar de usar puntos únicos (es decir, área de pico en una HPLC, tiempo de retención de pico). El caso de estudio aquí demuestra el uso de FDE para informar el desarrollo del método HPLC para producir un método optimizado.
