大家好，我叫 Ben，最近作为实习生加入 JMP，专注于为 JMP Pro 17 中提供的功能数据浏览器平台开发内容（您可以在此处阅读有关我的更多信息）。我目前正在曼彻斯特大学攻读化学工程博士学位，重点研究槐糖脂生物表面活性剂的生产。这让我对生物产品开发早期阶段的潜在数据/处理数据的需求有了很多了解。这里的案例研究描述了我开发一种分析方法来正确检测槐糖脂生物表面活性剂的工作，使用功能数据分析和功能能源部来指导我的实验方案。
您喜欢这个案例研究的哪些方面？
- 它使用功能数据分析和 FDoE – 可以显示功能数据浏览器工具的两个主要组件
- 数据集是真实的并且基于实际的开发工作
- 您可以展示非常引人注目的视觉效果 - “哇”因素。
- 您可以利用FDE平台轻松进行预处理（对齐、过滤）
它是给谁用的？
- 任何参与分析开发的人——包括化学、生物和制药行业。
- 研发部门的任何人都应该能够看到它如何转化为他们的情况。
我应该如何使用它？
- 您可以使用它来演示 JMP Pro 中的功能 DoE 工具。随附的数据表已保存流程每个阶段的脚本，或者您可以按照下面的案例研究详细信息来重新创建工作。
- 您可以使用它来展示简化 Function Data Explorer 平台中的数据呈现的能力。
我们可以使用哪些平台？
背景
槐糖脂生物表面活性剂是通过酵母与糖、油和氮的发酵产生的，由亲水头和疏水尾组成。与许多生物产品一样，单次发酵中这些结构在化学键、链长和官能团（仅举几例）方面存在巨大差异。对于分析科学家来说，在使用高效液相色谱 (HPLC) 等分析工具时有效分离这些化合物提出了挑战。
在本案例研究中，我面临着尝试开发一种能够使用 HPLC-UV 定量槐糖脂生物表面活性剂的方法的挑战，而这是以前从未做过的。不幸的是，我最初的方法无法通过 HPLC 将两种槐糖脂同源物（C18:1 和 C17:1）与另一种分离。它们仅相差一个碳，这意味着它们具有相似的吸光度（它们吸收的光的波长）和保留时间（它们出现在 HPLC 光谱上的时间）。我无法改变吸光度，但我可以调整 HPLC 方法来改变两种产品的保留时间，以便更好地分离它们。峰分离在分析中至关重要，因为峰面积用于计算给定化合物的浓度 - 如果没有“独立”峰，这种计算本质上是有缺陷的，可能会导致读数不准确。这里描述的例子代表了分析中的一个常见挑战，并且与各种工业和研究团体相关。
目标
- 优化 HPLC 设置以有效分离 C18:1 和 C17:1 峰
- 确保峰敏感（峰高无重大损失）和特异性（无宽峰）
方法开发 – 美国能源部初始申请
为了优化 HPLC 方法，我应用了一个简单的 DoE，调整了该方法的温度（30、35 和 40 o C）和流速（0.7 和 1.4 mL/min）。每次迭代都测试相同浓度的槐糖脂样品，并且所有其他条件始终保持恒定。
HPLC 的输出是色谱图 – 它测量波长 (198 nm) 随时间变化的吸光度强度，每个峰代表从 HPLC 出来并撞击检测器的化合物 – 每种化合物与 HPLC 色谱柱相互作用的时间越长，其作用时间就越长到达检测器所需的时间，导致保留时间较晚。大多数进行 HPLC 的样品都包含数百种化合物（包括您感兴趣的化合物），生成非常复杂的图表，无法通过肉眼辨别每种设置之间的具体差异。
更复杂的是，设置的变化（特别是流速）意味着我们感兴趣的峰（对于 C18:1 和 C17:1 形式）没有相同的保留时间。这不仅使得很难选出峰值，而且当您进行多次运行而不使图形变得过于复杂时，也很难生成比较图。
Function Data Explorer 和 FDoE 工具的应用
为了探索色谱图的变化，应用了功能数据浏览器工具（分析 > 专业建模 > 功能数据浏览器）。如上所述应用设置。
初始数据集显示所有非常繁忙的色谱图，而感兴趣的区域位于 22-30 分钟之间出现的 C18:1 和 C17:1 峰。使用Commands>Filter X工具，时间范围从 22-30 分钟减少。
为了在比较中获得任何有意义的信息，需要对齐分离的峰（由于流速的变化而变化）。由于目标峰在目标范围内具有最大强度（特定化合物的 HPLC 中通常出现这种情况），因此可以使用Align>Align Maximum工具轻松完成此操作。另一个过滤器 X用于将范围缩小到感兴趣的峰值（-1 到 +1 对齐时间）。峰对齐在分析中被大量使用，特别是在 LC-MS 和 HPLC 工艺开发中，并且通过 FDE 工具轻松应用它对于分析科学家来说非常有用。
现在数据已准备好进行分析，应用小波模型（下拉菜单 > 模型 > 小波），因为它最适合色谱数据。为了能够分析改变温度和流速的影响，使用小波 DoE （下拉菜单 > 小波 DoE 分析）来分析色谱图。
查看流速的变化（左），FDoE 分析器可以轻松演示流速的变化如何导致峰锐化（通过峰强度值的增加显示）以及第二个峰（C17： 1 化合物）。除此之外，温度的变化（右）进一步改善了峰的分离和锐化。从该分析仪中可以清楚地看出，峰正在分离，但分离不充分——这表明需要进行更多的实验运行。
进一步运行
根据 Wavelet 功能 DoE 分析器的输出，执行了 4 次额外的运行 - 2 次观察升高的温度（45 和 50 o C），2 次观察增加的流速和温度（45 o C，1.6 和 1.8 mL/min）。色谱数据被添加到先前的数据集，并且功能数据浏览器工具用于生成小波 DoE 分析器，如上所述。
FDoE/小波分析仪能够证明流速对 HPLC 的回报递减 - 它在较高流速下并没有大大改善峰分离，并导致峰高降低（意味着灵敏度降低）。由于分离效果没有显着改善，因此流速保持在 1.4mL/min 以维持色谱柱的运行（较高的流速可能对 HPLC 不利，因此这能够平衡风险与回报）。
在观察温度时，轮廓仪能够在峰高（提高灵敏度）和第二个峰的分离方面显示出显着的改进
为什么这很重要？
从客户的角度来看，FDE 和 FDoE 的需求可以通过一个简单的问题来解释：
您愿意尝试解释一下其中的差异吗？
或这个？
使用 FDE 平台可以节省大量时间，简化结果生成，并在讨论结果时可以更轻松地与非中小企业进行讨论。当它与 FDoE 相切时，您将获得一个强大的工具，可以识别功能数据/配置文件的整体变化，而不是使用单个点（即 HPLC 中的峰面积、峰保留时间）。这里的案例研究展示了如何使用 FDE 来指导 HPLC 方法的开发，以产生优化的方法。
更新 (06Jan22)：添加目标函数（数据库已更新）
我已更新 FDE 模型以包含 HPLC 方法的目标函数。这可以在数据处理 > 目标函数下上传。目标是完全分离峰（两侧强度均为 0），同时仍保留高而尖锐的峰。请注意，目标不必用“对齐时间”x 轴写入：所有处理步骤也将更改目标。
分析器现在包含一个“优化目标”按钮，可以找到实现最接近目标的温度和流速设置。
更新(14Mar23): 如何建立目标
在随附的数据集“构建目标的示例 - HPLC.jmp”中，我获取了一条“接近”我想要的 HPLC 曲线，但尚未完全达到我的目标（峰完全分离，峰更尖锐）-我可以使用这个数据集并选择我想要更改的数据点。在我的例子中：
1. 选择两个峰之间的波谷中的数据点并将其更改为零
2. 删除了峰尖处的数据点数量，以确保峰“更尖锐”
3. 删除了每个峰值“上下”运行的数据点。
然后，我使用样条工具并调整 lambda 值以获得数据的最佳拟合曲线 - 我发现这确实引起了客户的共鸣，因此值得展示 lambda 如何改变形状。然后，我使用“保存公式”保存样条线值 - 然后将它们作为目标复制到数据库中。
你好@约瑟夫_里斯，感谢您的评论，很高兴您喜欢这个例子。
- 我很乐意将其作为更广泛社区的博客文章 - 可能作为 FDE 的短片
- 我假设当您的客户提到减少杂质时，他们指的是在色谱图中将它们与感兴趣的峰分离。 在这种情况下，我建议他们分两步进行：
A) 按计划运行 DOE（或其他实验批次数据），并通过实际数据集确定最佳设置（这可以由 DOE 分析器告知）
获取该目标配置文件并根据他们的要求进行调整。 我在原始文章中附上了一个示例，说明如何将目标曲线放在一起 - 在这个示例中，我从运行中获取了一条“良好”曲线并对其进行了调整，以确保峰值之间有明显的间隙（零两侧的强度）并调整峰尖处的宽度。 您可以使用图形生成器中的样条工具创建平滑公式，然后将其带回到原始数据表中作为目标（如果更改 Lambda，您可以获得所需的拟合值）。
- 对于目标曲线，目前确实需要手动操作 - 我上面描述的方法效果很好，但依赖于操作当前数据。 如果能添加一个插件来绘制你想要的图表，那就太棒了。 我对客户说的是，目标并不总是完美的 - 在这种情况下，我可以只使用两个相邻的粗糙“三角形”来代表峰值 - 模型仍然会尽力做到最好来优化设置。
- 从我测试的不同数据集中，FDOE 诊断图中看到的曲线类型相当正常 - 很多时候，最糟糕的罪魁祸首是位于设计边缘的设置。 在此示例中，红色值位于我的设计的边缘，并且不包含在“均匀”设计空间内。 更多的重复也将有助于改善这一点。
你好@Bingh94 ，谢谢您这篇精彩的帖子！ 这对我来说非常及时，因为我刚刚被问到如何使用 FDE 来最大限度地减少 HPLC 分析中的杂质。 我在阅读本文时遇到了一些问题和评论，希望得到任何反馈！
- 这可以是自己的博客文章或短视频演示吗？ 这听起来像是已经适合外部受众的内容，并且 FDE 示例越多越好！
- 在我客户的例子中，如果您专注于减少杂质，目标曲线是否是最好的方法？ 或者最好使用 FDOE 分析器和合意性设置来最小化某些峰值？
- 关于目标曲线的主题，我们的客户是否有一种简单的方法来创建目标曲线，或者大多数人是否通过尝试输入适合其预期配置文件的数据集来手动执行此操作？考虑一下加载项如何帮助创建基于在图表上绘制的数据集或以某种方式修改现有曲线（类似于我们与意愿曲线交互的方式）？
- 最后一个问题...在您的示例中，FDOE 诊断图显示了一些不寻常的模式。 我们应该对此有多关心，解决这个问题是否需要安装额外的 GenReg 模型，或者这是否表明我们需要更多数据？
再次感谢您在这里所做的出色工作！
谢谢 Ben！！这是 JMP Pro DEMO 的绝佳资源！看到这篇文章真的很高兴！
