皆さん、こんにちは。私の名前はベンです。私は最近インターンとして JMP に入社し、JMP Pro 17 で利用可能な Functional Data Explorer プラットフォームのコンテンツ開発に重点を置いています (私の詳細については、 こちらをご覧ください)。私は現在、マンチェスター大学でソホロリピッドバイオサーファクタントの生産に焦点を当てて化学工学の博士号を取得中です。これにより、バイオ製品開発の初期段階におけるデータ処理の潜在的なデータやニーズについて多くの洞察が得られました。ここでのケーススタディでは、機能データ分析と機能 DoE を使用して実験プロトコルをガイドし、ソホロリピッド生物界面活性剤を正確に検出する分析方法の開発における私の研究について説明します。
このケーススタディのどこが気に入っていますか?
- 機能データ分析と FDoE を使用します。機能データ エクスプローラー ツールの両方の主要コンポーネントを表示できます。
- データセットは本物であり、実際の開発作業に基づいています
- 非常に魅力的なビジュアル、つまり「すごい」要素を示すことができます。
- FDEプラットフォームを利用して前処理（アライメント、フィルタリング）を簡単に行うことができます。
誰のためですか？
- 化学、生物学、製薬産業など、分析開発に携わるすべての人。
- 研究開発部門の担当者なら誰でも、それが自分たちの状況にどのように反映されるかを理解できるはずです。
どのように使用すればよいですか?
- これを使用して、JMP Pro の Functional DoE ツールをデモすることができます。添付のデータ テーブルには、プロセスの各段階のスクリプトが保存されています。または、以下のケース スタディの詳細に従って作業を再作成することもできます。
- これを使用して、Functional Data Explorer プラットフォームでのデータ表示を簡素化する機能を示すことができます。
どのようなプラットフォームを使用できますか?
背景
ソホロ脂質バイオサーファクタントは、親水性の頭部と疎水性の尾部で構成される糖、油、窒素による酵母の発酵によって生成されます。多くのバイオ製品と同様に、これらの構造には、化学結合、鎖長、官能基 (いくつか例を挙げると) の点で、単一の発酵で大幅に異なります。これは分析科学者にとって、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) などの分析ツールを使用する際にこれらの化合物を効率的に分離するという点で課題となります。
このケーススタディでは、これまで行われていなかった HPLC-UV を使用してソホロリピッドバイオサーファクタントを定量できるメソッドを作成するという課題に直面しました。残念ながら、私の最初の方法では、HPLC を使用して 2 つのソホロ脂質同族体 (C18:1 および C17:1) を別の同族体から分離することができませんでした。それらは炭素が 1 つだけ異なるだけで、吸光度 (吸収する光の波長) と保持時間 (HPLC スペクトルに現れる時間) が類似していることを意味します。吸光度を変えることはできませんでしたが、HPLC メソッドを適用して 2 つの製品の保持時間を変更し、分離を良くすることはできました。ピーク面積は特定の化合物の濃度を計算するために使用されるため、ピーク分離は分析において極めて重要です。「独立した」ピークがなければ、この計算には本質的に欠陥があり、不正確な測定値が得られる可能性があります。ここで説明する例は、分析における共通の課題を表しており、さまざまな業界および研究グループに関連しています。
目的
- C18:1 ピークと C17:1 ピークを効果的に分離するために HPLC 設定を最適化するには
- ピークが高感度であること (ピーク高さが大幅に低下していないこと) と特異的であること (ブロードなピークがないこと) を確認します。
メソッド開発 – 最初の DoE アプリケーション
HPLC メソッドを最適化するために、メソッドの温度 (30、35、および 40 ℃ ) と流量 (0.7 および 1.4 mL/min) を適応させるシンプルな DoE を適用しました。同じ濃度のソホロリピッド サンプルを反復ごとにテストし、他のすべての条件を全体を通して一定に保ちました。
HPLC の出力はクロマトグラムです。これは、経時的な波長 (198nm) での吸光度の強度を測定します。各ピークは、HPLC から出てきて検出器に到達する化合物を表します。各化合物が HPLC カラムと相互作用する時間が長ければ長いほど、検出器に到達するまでに時間がかかるため、保持時間が遅くなります。 HPLC に投入されるほとんどのサンプルには、数百の化合物 (目的の化合物を含む) が含まれており、各設定間の具体的な違いを目で識別することが不可能な非常に複雑なグラフが生成されます。
さらに問題を複雑にしているのは、設定 (特に流量) の変更により、目的のピーク (C18:1 および C17:1 フォーム) の保持時間が同じではなくなったことです。これにより、ピークを特定することが難しくなるだけでなく、多数の実行がある場合に、グラフが過度に複雑になることなく比較グラフを作成することも非常に困難になります。
Functional Data Explorer と FDoE ツールのアプリケーション
クロマトグラムへの変化を調査するために、Functional Data Explorer ツールを適用しました (Analyze > Specialized Modeling > Functional Data Explorer)。上記のように設定が適用されました。
初期データセットは非常に混雑したクロマトグラムをすべて示していましたが、対象領域は 22 ～ 30 分の間に発生した C18:1 および C17:1 ピークでした。 [コマンド] > [フィルター X]ツールを使用すると、時間範囲が 22 ～ 30 分から短縮されました。
比較で意味のあるものを得るには、分離されたピーク (流量の変化によって変化した) を位置合わせする必要がありました。対象のピークは対象の範囲内で最大の強度を持っていたため (特定の化合物の HPLC では通常そうである)、これは[Align] > [Align Maximum]ツールを使用して簡単に実行できました。別のフィルター Xを使用して、範囲を対象のピーク (-1 から +1 の整列時間) に縮小しました。ピークアライメントは分析、特に LC-MS および HPLC のプロセス開発でよく使用されており、FDE ツールで簡単に適用できることは分析科学者にとって非常に役立ちます。
データを分析する準備ができたので、クロマトグラフィー データに最もよく適合するウェーブレット モデル(ドロップダウン > モデル > ウェーブレット)が適用されました。温度と流量の変化の影響をプロファイリングできるようにするために、ウェーブレット DoE (ドロップダウン > ウェーブレット DoE 分析)を使用してクロマトグラムのプロファイリングを行いました。
流量の変化 (左) を見ると、FDoE プロファイラーは、流量の変化によってどのようにピークが尖り (ピーク強度値の増加で示される) と 2 番目のピーク (C17: 1化合物）。これに加えて、温度を変化させると (右)、ピークの分離と鮮明さがさらに改善されました。このプロファイラーから、ピークは分離しているものの十分ではないことが明らかになりました。これは、さらなる実験の実行が必要であることを示していました。
さらなる走行
ウェーブレット関数 DoE プロファイラーの出力から、さらに 4 つの実行が実行されました。2 つは温度の上昇 (45 および 50 ℃ ) を調べ、2 つは流量と温度の上昇 (45 ℃ 、1.6 および 1.8 mL/min) を調べました。クロマトグラフィー データは前のデータセットに追加され、Functional Data Explorer ツールを使用して、上記のウェーブレット DoE プロファイラーが作成されました。
FDoE/ウェーブレット プロファイラーは、流量によって HPLC の利益が減少することを実証できました。流量が高くなるとピーク分離はあまり改善されず、ピーク高さの減少 (感度の低下を意味します) につながりました。分離に顕著な改善が見られなかったため、カラムを維持するために流速を 1.4 mL/min に維持しました (流速が高くなると HPLC に悪影響を及ぼす可能性があるため、これによりリスクと報酬のバランスをとることができました)。
温度を見ると、プロファイラーはピーク高さ (感度の向上) と 2 番目のピークの分離の両方で大幅な改善を示すことができました。
なぜこれが重要なのでしょうか?
顧客の観点から見ると、FDE と FDoE の必要性は次のような簡単な質問で説明できます。
これとの違いを説明してみませんか？
それともこれ？
FDE プラットフォームを使用すると、時間を大幅に節約し、結果生成を合理化し、結果について議論する際に SME 以外との議論を容易にすることができます。これを FDoE と組み合わせると、単一点 (つまり、HPLC のピーク面積、ピーク保持時間) を使用するのではなく、機能データ/プロファイルの変化全体を識別できる強力なツールが得られます。ここでのケーススタディは、最適化されたメソッドを生成するための HPLC メソッドの開発に情報を提供するための FDE の使用を示しています。
更新 (06Jan22): ターゲット関数の追加 (データベース更新)
FDE モデルを更新して、HPLC メソッドのターゲット関数を追加しました。これは、[データ処理] > [ターゲット関数] でアップロードできます。目標は、高くて鋭いピークを保持したまま、ピークを完全に分離すること (どちらかの側の強度が 0 であること) を目指すことです。ターゲットは「調整された時間」X 軸で書き込む必要がないことに注意してください。すべての処理ステップでターゲットも変更されます。
プロファイラーには、ターゲットに最も近いプロファイルを実現する温度と流量の設定を見つける「ターゲットの最適化」ボタンが含まれています。
アップデート(14Mar23): ターゲットの構築方法
添付のデータセット「ターゲットの構築例 - HPLC.jmp」では、希望するものに「近い」HPLC 曲線を取得しましたが、ターゲット (ピークの完全な分離、ピークのシャープさ) には完全には達していません。このデータセットを使用して、変更したいデータポイントを選択できます。例では次のようになります。
1. 2 つのピークの間の谷にあるデータ ポイントを選択し、それらをゼロに変更します。
2. ピークの先端にあるデータ ポイントの数を削除して、ピークをより「シャープ」にしました
3. 各ピークの「上下」にあるデータ ポイントを削除しました。
次に、スプライン ツールを使用してラムダ値を調整し、データに最適な曲線を取得しました。これは顧客の共感を呼ぶことがわかりました。そのため、ラムダが形状をどのように変更するかを示すことは価値があります。次に、[式の保存] を使用してスプライン値を保存し、それらをターゲットとしてデータベースにコピーします。
こんにちは@Joseph_Reese 、コメントありがとうございます。例を気に入っていただけて嬉しいです。
- これを広範なコミュニティ向けのブログ投稿として喜んで掲載します - おそらく FDE 向けの短いビデオとして
- お客様が不純物の削減について言及しているとき、クロマトグラム上で不純物を関心のあるピークから分離することについて話しているのではないかと思います。 この場合、次の 2 段階のプロセスを実行することをお勧めします。
A) DOE (または他の実験バッチデータ) を計画どおりに実行し、実際のデータセットを通じて最適な設定を特定します (これは DOE プロファイラによって通知されます)。
そのターゲットプロファイルを取得し、要件に従って調整します。 元の記事に、ターゲット カーブをまとめた例をここに添付しました。この例では、実行から「良好な」カーブを取得し、ピーク間に明確なギャップがあることを確認するように調整しました (ゼロ両側の強度）を調整し、先端のピークの幅を調整しました。 グラフ ビルダーのスプライン ツールを使用して平滑化された数式を作成し、それをターゲットとして元のデータ テーブルに戻すことができます (ラムダを変更すると、必要なフィットを得ることができます)。
- ターゲット曲線の場合、現時点では実際には手動操作になります。上で説明した方法はうまく機能しますが、現在のデータの操作に依存します。 希望のグラフを描画するためのアドインは素晴らしいでしょう。 私が顧客に言ったことは、目標は常に完璧である必要はないということです - この場合、ピークを表すために隣り合った 2 つの粗末な「三角形」を使用するだけで済みました - モデルはそれでも最善を尽くします設定を最適化します。
- 私がテストしたさまざまなデータセットから、FDOE 診断プロットに見られる曲線のタイプはかなり正常です。多くの場合、最悪の原因は設計の端にある設定です。 この例では、赤い値がデザインの端にあり、「偶数」のデザイン空間内に含まれていません。 複製を増やすと、これも改善できます。
こんにちは@Bingh94 , この素晴らしい投稿をありがとうございます。 HPLC アッセイにおける不純物を最小限に抑えるために FDE をどのように使用できるかについて質問されたばかりだったので、これは私にとって非常にタイムリーでした。 これを読んでいる間にいくつか質問やコメントがありましたので、フィードバックをいただければ幸いです。
- これを独自のブログ投稿または短いビデオデモにすることはできますか? これはすでに外部の読者向けに適しているように見えますが、FDE の例が多ければ多いほど良いものになります。
- 私の顧客の例では、不純物の削減に重点を置く場合、目標曲線が最善の方法でしょうか? それとも、特定のピークを最小限に抑えるために、FDOE プロファイラーと望ましさの設定を使用することが望ましいでしょうか?
- ターゲット カーブについてですが、お客様がターゲット カーブを作成する簡単な方法はありますか、それともほとんどの人が、目的のプロファイルに適合するデータセットを入力して手動で作成しているのでしょうか?アドインが、グラフ上に描画したり、満足度曲線を操作するのと同じように既存の曲線を何らかの方法で変更したりして、データセットを作成するのにどのように役立つか考えてみませんか?
- 最後の質問...あなたの例では、FDOE 診断プロットはいくつかの異常なパターンを示しています。 このことについてどの程度懸念すべきでしょうか。また、これに対処するには追加の GenReg モデルをフィッティングする必要があるでしょうか、それともこれはより多くのデータが必要であることを示しているのでしょうか?
ここでの素晴らしい仕事に改めて感謝します!
素晴らしいケーススタディです。今後のデモに使用します:)
ありがとう、ベン！これは JMP Pro DEMO の素晴らしいソースです！この投稿を見て本当に興奮しています！
