Ciao a tutti, mi chiamo Ben e di recente sono entrato a far parte di JMP come stagista concentrandomi sullo sviluppo di contenuti per la piattaforma Functional Data Explorer disponibile in JMP Pro 17 (potete leggere ulteriori informazioni su di me qui ). Attualmente sto studiando il mio dottorato di ricerca in ingegneria chimica presso l'Università di Manchester con particolare attenzione alla produzione di biosurfattanti soforolipidi. Ciò mi ha dato molte informazioni sui potenziali dati/necessità di elaborazione dei dati nelle prime fasi di sviluppo dei bioprodotti. Il caso di studio qui descrive il mio lavoro nello sviluppo di un metodo analitico per rilevare correttamente i biotensioattivi soforolipidi, utilizzando l'analisi dei dati funzionali e la DoE funzionale per guidare il mio protocollo sperimentale.
Cosa ti piace di questo caso di studio?
- Utilizza l'analisi dei dati funzionali e FDoE: può mostrare entrambi i componenti principali dello strumento Functional Data Explorer
- Il set di dati è reale e basato sul lavoro di sviluppo effettivo
- Puoi mostrare immagini molto accattivanti: fattore "wow".
- Puoi utilizzare la piattaforma FDE per eseguire facilmente la pre-elaborazione (allineamento, filtraggio)
Per chi è?
- Chiunque sia coinvolto nello sviluppo analitico, comprese le industrie chimiche, biologiche e farmaceutiche.
- Chiunque faccia parte della ricerca e sviluppo dovrebbe essere in grado di vedere come ciò potrebbe tradursi nella loro situazione.
Come dovrei usarlo?
- Puoi usarlo per provare lo strumento Functional DoE in JMP Pro. La tabella dati allegata contiene script salvati per ogni fase del processo oppure puoi seguire i dettagli del case study riportati di seguito per ricreare il lavoro.
- Puoi usarlo per mostrare la possibilità di semplificare la presentazione dei dati nella piattaforma Functional Data Explorer.
Quali piattaforme possiamo utilizzare?
- Costruttore di grafici
- Esplora dati funzionali
Sfondo
I biotensioattivi soforolipidi sono prodotti dalla fermentazione di un lievito con zucchero, olio e azoto composti da una testa idrofila e una coda idrofoba. Come per molti prodotti biologici, vi è un'enorme variazione in queste strutture in una singola fermentazione in termini di legami chimici, lunghezza della catena e gruppi funzionali (solo per citarne alcuni). Per gli scienziati analitici ciò rappresenta una sfida in termini di separazione efficiente di questi composti quando si utilizzano strumenti analitici come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
In questo caso di studio, mi sono trovato di fronte alla sfida di provare a produrre un metodo in grado di quantificare i biotensioattivi soforolipidi con HPLC-UV, cosa che non era mai stata realizzata in precedenza. Sfortunatamente, il mio metodo iniziale non era in grado di separare due congeneri dei soforolipidi (C18:1 e C17:1) da un altro mediante HPLC. Differivano solo per un carbonio, il che significa che avevano un'assorbanza (la lunghezza d'onda della luce che assorbono) e un tempo di ritenzione (il tempo in cui appaiono su uno spettro HPLC) simili. Non potevo fare nulla per modificare l'assorbanza, ma potevo adattare il mio metodo HPLC per modificare il tempo di ritenzione dei due prodotti in modo che si separassero meglio. La separazione dei picchi è fondamentale nell'analisi poiché l'area del picco viene utilizzata per calcolare la concentrazione di un determinato composto: senza picchi "autonomi" questo calcolo è intrinsecamente errato e può portare a letture imprecise. L'esempio qui descritto rappresenta una sfida comune nell'analisi e ha rilevanza per un'ampia varietà di gruppi industriali e di ricerca.
Obiettivi
- Per ottimizzare le impostazioni dell'HPLC al fine di separare efficacemente i picchi C18:1 e C17:1
- Assicurarsi che i picchi siano sensibili (nessuna perdita importante nell'altezza del picco) e specifici (nessun picco ampio)
Sviluppo del metodo – Applicazione DoE iniziale
Per ottimizzare il metodo HPLC, ho applicato una semplice DoE che adattava la temperatura (30, 35 e 40 oC ) e la velocità di flusso (0,7 e 1,4 ml/min) del metodo. La stessa concentrazione del campione di soforolipidi è stata testata in ogni iterazione e tutte le altre condizioni sono state mantenute costanti durante tutto il processo.
L'output per l'HPLC è un cromatogramma – questo misura l'intensità dell'assorbanza a una lunghezza d'onda (198 nm) nel tempo, ciascun picco rappresenta un composto che esce dall'HPLC e colpisce il rilevatore – più a lungo ciascun composto interagisce con la colonna HPLC, più a lungo dura impiega per raggiungere il rilevatore, causando un ritardo nel tempo di ritenzione. La maggior parte dei campioni inseriti negli HPLC contengono centinaia di composti (incluso il composto di interesse) producendo un grafico molto congestionato che rende impossibile distinguere a occhio le differenze specifiche tra ciascuna impostazione.
A complicare ulteriormente le cose, la modifica delle impostazioni (in particolare della portata) ha fatto sì che il nostro picco di interesse (per le forme C18:1 e C17:1) non avesse lo stesso tempo di ritenzione. Ciò non solo rende difficile individuare il picco, ma rende anche molto difficile produrre un grafico di confronto quando si hanno numerose esecuzioni senza che il grafico diventi eccessivamente complicato.
Applicazione dello strumento Functional Data Explorer e FDoE
Per esplorare le modifiche al cromatogramma è stato applicato lo strumento Functional Data Explorer (Analizza > Modellazione specializzata > Functional Data Explorer). Le impostazioni sono state applicate come sopra.
Il set di dati iniziale mostrava tutto il cromatogramma che era molto occupato, mentre la regione di interesse era nei picchi C18:1 e C17:1 che si verificavano tra 22 e 30 minuti. L'intervallo di tempo è stato ridotto da 22-30 minuti utilizzando lo strumento Comandi>Filtro X.
Per ottenere qualcosa di significativo nel confronto, i picchi separati (modificati a causa della variazione della portata) dovevano essere allineati. Poiché i picchi di interesse avevano l'intensità maggiore nell'intervallo di interesse (come avviene tipicamente nell'HPLC per composti specifici), ciò è stato fatto facilmente con lo strumento Allinea>Allinea massimo . Un altro filtro X è stato utilizzato per ridurre l'intervallo solo al picco di interesse (tempo allineato da -1 a +1). L'allineamento dei picchi è molto utilizzato nell'analisi, in particolare nello sviluppo di processi LC-MS e HPLC e la facilità di applicazione con lo strumento FDE è molto utile per gli scienziati analitici.
Ora che i dati erano pronti per l'analisi, è stato applicato un modello Wavelet (elenco a discesa > Modelli > Wavelets) poiché si adattava meglio ai dati cromatografici. Per poter profilare l'effetto della modifica della temperatura e della portata, è stato utilizzato Wavelet DoE (Dropdown > Wavelets DoE Analysis) per profilare il cromatogramma.
Osservando la variazione di portata (a sinistra), il profiler FDoE dimostra facilmente come la variazione di portata provochi un'acutizzazione del picco (mostrato dall'aumento del valore dell'intensità del picco) e la comparsa di un secondo picco (il C17: 1 composto). Oltre a ciò, i cambiamenti di temperatura (a destra) hanno ulteriormente migliorato questa separazione e l'acutizzazione del picco. Da questo profiler è apparso chiaro che i picchi si stavano separando ma non in modo sufficiente : ciò indicava che erano necessarie ulteriori esecuzioni sperimentali.
Ulteriori corse
Dall'output del profilatore funzionale Wavelet DoE sono state eseguite 4 analisi aggiuntive: 2 osservando l'aumento della temperatura (45 e 50 oC ) e 2 con portata e temperatura del flusso aumentate (45 oC , 1,6 e 1,8 ml/min). I dati cromatografici sono stati aggiunti al set di dati precedente e lo strumento Functional Data Explorer è stato utilizzato per produrre un profiler Wavelet DoE come descritto sopra.
Il profiler FDoE/Wavelet è stato in grado di dimostrare che la portata aveva rendimenti decrescenti per l'HPLC: non ha migliorato notevolmente la separazione dei picchi a portate più elevate e ha portato a una diminuzione dell'altezza del picco (il che significa una sensibilità ridotta). Poiché non si è verificato alcun miglioramento significativo nella separazione, la portata è stata mantenuta a 1,4 ml/min per sostenere la colonna (portate più elevate possono essere dannose per le HPLC, quindi questo è stato in grado di bilanciare rischio e rendimento).
Osservando la temperatura, il profiler è stato in grado di mostrare miglioramenti significativi sia nell'altezza del picco (migliorando la sensibilità) che nella separazione del secondo picco
Perché è importante?
Dal punto di vista del cliente, la necessità di FDE e FDoE può essere spiegata con una semplice domanda:
Preferiresti provare a spiegare le differenze con questo?
O questo?
L'uso della piattaforma FDE può garantire un notevole risparmio di tempo, semplificare la produzione dei risultati e consentire discussioni più semplici con soggetti non PMI quando si discutono i risultati. Quando questo viene messo in tangenza con FDoE si ottiene un potente strumento in grado di identificare l'intero cambiamento nei dati/profili funzionali, piuttosto che utilizzare singoli punti (ad esempio l'area del picco in un HPLC, il tempo di ritenzione del picco). Il caso di studio qui dimostra l'uso della FDE per orientare lo sviluppo del metodo HPLC per produrre un metodo ottimizzato.
Aggiornamento (06 gennaio 22): aggiunta di una funzione target (database aggiornato)
Ho aggiornato il modello FDE per includere una funzione Target per il metodo HPLC. Questo può essere caricato in Elaborazione dati > Funzioni target. L'obiettivo mira ad avere picchi completamente separati (con intensità 0 su entrambi i lati) che conservino ancora un picco alto e acuto. Si noti che il target non doveva essere scritto con un asse x "temporale allineato": anche tutte le fasi di elaborazione modificheranno il target.
Il profiler ora contiene un pulsante "Ottimizza target" che troverà le impostazioni di temperatura e portata che raggiungono il profilo più vicino al target.
Aggiornamento(14mar23): Come costruire un bersaglio
Nel set di dati allegato "Esempio di costruzione di un target - HPLC.jmp" ho preso una curva HPLC che è "vicina" a ciò che desidero ma non ha raggiunto del tutto i miei obiettivi (separazione completa dei picchi, picchi più nitidi) - Posso utilizzare questo set di dati e selezionare i punti dati che desidero modificare. Nell'esempio I:
1. Selezionato i punti dati nella valle tra i due picchi e li ha modificati a zero
2. Rimosso il numero di punti dati sulla punta dei picchi per garantire un picco "più nitido".
3. Rimossi i punti dati che corrono "su e giù" per ciascun picco.
Ho quindi utilizzato lo strumento spline e regolato il valore lambda per ottenere la curva più adatta ai miei dati: ho scoperto che questo è molto apprezzato dai clienti, quindi vale la pena mostrare come la lambda cambia la forma. Quindi utilizzo "Salva formula" per salvare i valori della spline, quindi li copio come destinazione nel database.
CIAO @Joseph_Reese , grazie per i commenti, felice che ti sia piaciuto l'esempio.
- Sarei felice di pubblicarlo come post sul blog per la comunità più ampia, probabilmente come un breve video per FDE
- Presumo che quando il tuo cliente si riferisce alla riduzione delle impurità, stia parlando di separarle sul cromatogramma dai picchi di interesse. In questo caso suggerirei di eseguire una procedura in due fasi:
A) Eseguire i loro DOE (o altri dati batch sperimentali) come pianificato e identificare le migliori impostazioni che hanno attraverso il loro set di dati effettivo (questo può essere informato dal profiler DOE)
Prendi quel profilo target e adattalo in base alle loro esigenze. Ho allegato un esempio nell'articolo originale di come ho messo insieme le curve target qui - in questo esempio ho preso una curva "buona" dalle mie corse e l'ho modificata per assicurarmi che i picchi avessero un divario distinto tra ciascuno (zero intensità su entrambi i lati) e regolato l'ampiezza dei picchi sulla punta. Puoi utilizzare lo strumento spline nel Costruttore di grafici per creare una formula smussata che puoi poi riportare nella tabella dati originale come target (se modifichi Lambda puoi ottenere l'adattamento di cui hai bisogno).
- Per le curve target al momento si tratta in realtà di manipolazione manuale: il metodo che ho descritto sopra funziona bene ma si basa sulla manipolazione dei dati correnti. Un componente aggiuntivo per disegnare il grafico desiderato sarebbe fantastico. Ciò che ho detto ai clienti è che l'obiettivo non deve essere sempre perfetto - in questo caso avrei potuto semplicemente usare due "triangoli" grezzi posti uno accanto all'altro per rappresentare i picchi - il modello avrebbe comunque fatto del suo meglio per ottimizzare le impostazioni.
- Dai diversi set di dati che ho testato, il tipo di curve visualizzate nei grafici diagnostici FDOE è abbastanza normale: nella maggior parte dei casi i peggiori colpevoli sono le impostazioni ai margini del progetto. In questo esempio i valori rossi sono ai margini del mio progetto e non sono contenuti in uno spazio di progettazione "pari". Più repliche aiuterebbero a migliorare anche questo.
CIAO @Bingh94 , GRAZIE per questo eccellente post! È di grande attualità per me poiché mi è stato appena chiesto come si potrebbe utilizzare la FDE per ridurre al minimo le impurità nei test HPLC. Ho avuto alcune domande e commenti durante la lettura di questo articolo e apprezzerei qualsiasi feedback!
- Può trattarsi di un post sul blog o di un breve video dimostrativo? Sembra qualcosa che sia già adatto a un pubblico esterno e più esempi di FDE ci sono, meglio è!
- Nell'esempio del mio cliente, se ti concentrassi sulla riduzione delle impurità, una curva target sarebbe la soluzione migliore? Oppure sarebbe preferibile utilizzare il profiler FDOE e le impostazioni di desiderabilità per ridurre al minimo determinati picchi?
- A proposito delle curve target, esiste un modo semplice per i nostri clienti di creare curve target o la maggior parte delle persone lo fa manualmente cercando di digitare un set di dati che si adatti al profilo previsto?Stai pensando a come forse un componente aggiuntivo potrebbe aiutare a creare un set di dati basato sul disegno su un grafico o sulla modifica in qualche modo delle curve esistenti in modo simile a come interagiamo con le curve di desiderabilità?
- Ultima domanda... nel tuo esempio i grafici diagnostici FDOE mostrano alcuni modelli insoliti. Quanto dovremmo preoccuparci di ciò e affrontare questo problema comporterebbe l’adattamento di ulteriori modelli GenReg o ciò indicherebbe che abbiamo bisogno di più dati?
Grazie ancora per l'ottimo lavoro qui!
