Salve a tutti, mi chiamo Ben e sono recentemente entrato a far parte di JMP come stagista concentrandomi sullo sviluppo di contenuti per la piattaforma Functional Data Explorer disponibile in JMP Pro 17 (potete leggere di più su di me qui ). Attualmente sto studiando il mio dottorato di ricerca in ingegneria chimica presso l'Università di Manchester con un focus sulla produzione di biosurfattanti soforolipidi. Questo mi ha fornito molte informazioni sui potenziali dati/esigenze per l'elaborazione dei dati nelle prime fasi di sviluppo dei prodotti biologici. Il caso di studio qui descrive il mio lavoro nello sviluppo di un metodo analitico per rilevare correttamente i biosurfattanti soforolipidi, utilizzando l'analisi dei dati funzionali e il DoE funzionale per guidare il mio protocollo sperimentale.
Cosa ti piace di questo case study?
- Utilizza l'analisi dei dati funzionali e FDoE: può mostrare entrambi i componenti principali dello strumento Functional Data Explorer
- Il set di dati è reale e basato sul lavoro di sviluppo effettivo
- Puoi mostrare immagini molto accattivanti - fattore "wow".
- È possibile utilizzare la piattaforma FDE per eseguire facilmente la pre-elaborazione (allineamento, filtraggio)
Per chi è?
- Chiunque sia coinvolto nello sviluppo analitico, comprese le industrie chimiche, biologiche e farmaceutiche.
- Chiunque si occupi di ricerca e sviluppo dovrebbe essere in grado di vedere come potrebbe tradursi nella propria situazione.
Come dovrei usarlo?
- Puoi utilizzarlo per eseguire una demo dello strumento Functional DoE in JMP Pro. La tabella dei dati allegata ha salvato gli script per ogni fase del processo oppure puoi seguire i dettagli del caso di studio di seguito per ricreare il lavoro.
- Puoi usarlo per mostrare la capacità di semplificare la presentazione dei dati nella piattaforma Functional Data Explorer.
Quali piattaforme possiamo utilizzare?
- Costruttore di grafici
- Esploratore di dati funzionali
Sfondo
I biosurfattanti soforolipidi sono prodotti dalla fermentazione di un lievito con zucchero, olio e azoto che sono composti da una testa idrofila e una coda idrofobica. Come per molti prodotti biologici, in una singola fermentazione vi è un'enorme variazione in queste strutture in termini di legami chimici, lunghezza della catena e gruppi funzionali (solo per citarne alcuni). Per gli scienziati analitici ciò rappresenta una sfida in termini di separazione efficiente di questi composti quando si utilizzano strumenti analitici come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
In questo caso di studio, ho dovuto affrontare la sfida di provare a produrre un metodo in grado di quantificare i biosurfattanti soforolipidi con HPLC-UV, cosa che non era stata fatta in precedenza. Sfortunatamente, il mio metodo iniziale non è stato in grado di separare due congeneri soforolipidi (C18:1 e C17:1) da un altro con HPLC. Differivano solo per un carbonio, il che significa che avevano un'assorbanza (la lunghezza d'onda della luce che assorbono) e un tempo di ritenzione simili (il tempo in cui appaiono su uno spettro HPLC). Non ho potuto fare nulla per modificare l'assorbanza, ma ho potuto adattare il mio metodo HPLC per modificare il tempo di ritenzione dei due prodotti in modo che si separino meglio. La separazione dei picchi è fondamentale nell'analisi poiché l'area del picco viene utilizzata per calcolare la concentrazione di un determinato composto: senza picchi "autonomi" questo calcolo è intrinsecamente errato e può portare a letture imprecise. L'esempio qui descritto rappresenta una sfida comune nell'analisi e ha rilevanza per un'ampia varietà di gruppi industriali e di ricerca.
Obiettivi
- Per ottimizzare le impostazioni HPLC al fine di separare efficacemente i picchi C18:1 e C17:1
- Assicurarsi che i picchi siano sensibili (nessuna perdita importante nell'altezza del picco) e specifici (nessun picco ampio)
Sviluppo del metodo – Applicazione DoE iniziale
Per ottimizzare il metodo HPLC, ho applicato un semplice DoE che ha adattato la temperatura (30, 35 e 40 o C) e portata (0,7 e 1,4 ml/min) del metodo. La stessa concentrazione di campione di soforolipidi è stata testata in ogni iterazione e tutte le altre condizioni sono state mantenute costanti per tutto il tempo.
L'output per l'HPLC è un cromatogramma: questo misura l'intensità dell'assorbanza a una lunghezza d'onda (198 nm) nel tempo, ogni picco rappresenta un composto che esce dall'HPLC e colpisce il rivelatore: più a lungo ogni composto interagisce con la colonna HPLC più a lungo impiega per raggiungere il rilevatore, provocando un ritardo nel tempo di ritenzione. La maggior parte dei campioni che vengono caricati su HPLC contengono centinaia di composti (incluso il composto di interesse) che producono a molto grafico occupato che rende impossibile discernere a occhio le differenze specifiche tra ogni impostazione.
A complicare ulteriormente le cose, la modifica delle impostazioni (in particolare la portata) ha fatto sì che il nostro picco di interesse (per le forme C18:1 e C17:1) non avesse lo stesso tempo di ritenzione. Questo non solo rende difficile individuare il picco, ma rende anche molto difficile produrre un grafico di confronto quando si hanno numerose esecuzioni senza che il grafico diventi troppo complicato.
Applicazione del Functional Data Explorer e dello strumento FDoE
Per esplorare le modifiche al cromatogramma è stato applicato lo strumento Functional Data Explorer (Analyze > Specialized Modeling > Functional Data Explorer). Le impostazioni sono state applicate come sopra.
Il set di dati iniziale ha mostrato tutto il cromatogramma che è molto occupato, mentre la regione di interesse era nei picchi C18:1 e C17:1 che si sono verificati tra 22-30 minuti. L'intervallo di tempo è stato ridotto da 22-30 minuti utilizzando il Comandi>Filtro X attrezzo.
Per ottenere qualcosa di significativo nel confronto, i picchi separati (modificati a causa della variazione della portata) dovevano essere allineati. Poiché i picchi di interesse avevano la massima intensità nell'intervallo di interesse (come è tipicamente il caso in HPLC per composti specifici), ciò è stato fatto facilmente con il Allinea>Allinea massimo attrezzo. Altro Filtro X è stato utilizzato per ridurre l'intervallo solo al picco di interesse (da -1 a +1 tempo di allineamento). L'allineamento dei picchi viene utilizzato molto nell'analisi, in particolare nello sviluppo di processi LC-MS e HPLC e la facilità di applicazione con lo strumento FDE è molto utile per gli scienziati analitici.
Ora che i dati erano pronti per l'analisi, un modello Wavelet (Menu a discesa > Modelli > Wavelet) è stato applicato in quanto ciò si adattava meglio ai dati cromatografici. Per essere in grado di profilare l'effetto della modifica della temperatura e della portata del Wavelet DoE (Menu a discesa > Analisi DoE Wavelet) è stato utilizzato per profilare il cromatogramma.
Osservando la variazione della portata (a sinistra), il profiler FDoE dimostra facilmente come la variazione della portata provochi un'acutizzazione del picco (mostrato dall'aumento del valore dell'intensità di picco) e la comparsa di un secondo picco (il C17: 1 composto). Oltre a ciò, i cambiamenti di temperatura (Destra) hanno ulteriormente migliorato questa separazione e l'affilatura del picco. Da questo profiler, è diventato chiaro che i picchi si stavano separando ma non sufficientemente – questo indicava che erano necessarie più corse sperimentali.
Ulteriori corse
Dall'output del profilatore DoE funzionale Wavelet sono state eseguite 4 analisi aggiuntive: 2 osservando l'aumento della temperatura (45 e 50 o C) e 2 con portata maggiorata e temperatura (45 o C, 1,6 e 1,8 ml/min). I dati cromatografici sono stati aggiunti al set di dati precedente e lo strumento Functional Data Explorer è stato utilizzato per produrre un profiler DoE Wavelet come descritto sopra.
Il profiler FDoE/Wavelet è stato in grado di dimostrare che la portata ha avuto rendimenti decrescenti per l'HPLC: non ha migliorato notevolmente la separazione dei picchi a portate più elevate e ha portato a una diminuzione dell'altezza del picco (che significa sensibilità ridotta). Poiché non vi è stato alcun miglioramento significativo nella separazione, la velocità di flusso è stata mantenuta a 1,4 ml/min per sostenere la colonna (velocità di flusso più elevate possono essere dannose per HPLC, quindi questo è stato in grado di bilanciare rischio e ricompensa).
Osservando la temperatura, il profiler è stato in grado di mostrare miglioramenti significativi sia nell'altezza del picco (migliorando la sensibilità) sia nella separazione del secondo picco
Perché è importante?
Dal punto di vista dei clienti, la necessità di FDE e FDoE può essere spiegata con una semplice domanda:
Preferiresti provare a spiegare le differenze con questo?
O questo?
L'uso della piattaforma FDE può fornire un notevole risparmio di tempo, semplificare la produzione dei risultati e consentire discussioni più facili con le non PMI durante la discussione dei risultati. Quando questo viene messo in tangente con FDoE si ottiene un potente strumento in grado di identificare l'intero cambiamento nei dati/profili funzionali, piuttosto che utilizzare singoli punti (es. area del picco in un HPLC, tempo di ritenzione del picco). Il caso di studio qui illustrato dimostra l'uso di FDE per informare lo sviluppo del metodo HPLC per produrre un metodo ottimizzato.
