Hallo zusammen, mein Name ist Ben und ich bin vor kurzem als Praktikant bei JMP eingestiegen und habe mich auf die Entwicklung von Inhalten für die Functional Data Explorer-Plattform konzentriert, die in JMP Pro 17 verfügbar ist (mehr über mich können Sie hier lesen). Derzeit studiere ich an der University of Manchester in Chemieingenieurwesen mit Schwerpunkt auf der Produktion von Sophorolipid-Biotensiden. Dies hat mir viele Einblicke in die potenziellen Daten/Anforderungen für die Datenverarbeitung in den frühen Phasen der Entwicklung von Bioprodukten gegeben. Die hier vorliegende Fallstudie beschreibt meine Arbeit bei der Entwicklung einer analytischen Methode zum korrekten Nachweis von Sophorolipid-Biotensiden, wobei ich funktionelle Datenanalyse und funktionelle DoE als Leitfaden für mein Versuchsprotokoll verwende.
Was gefällt Ihnen an dieser Fallstudie?
- Es nutzt funktionale Datenanalyse und FDoE – kann beide Hauptkomponenten des Functional Data Explorer-Tools anzeigen
- Der Datensatz ist real und basiert auf tatsächlicher Entwicklungsarbeit
- Sie können sehr überzeugende Bilder zeigen – ein „Wow“-Faktor.
- Sie können die FDE-Plattform nutzen, um die Vorverarbeitung (Ausrichtung, Filterung) einfach durchzuführen.
Für wen ist das?
- Jeder, der an der analytischen Entwicklung beteiligt ist – einschließlich der chemischen, biologischen und pharmazeutischen Industrie.
- Jeder in der Forschung und Entwicklung sollte sehen können, wie sich dies auf seine Situation übertragen lässt.
Wie soll ich es verwenden?
- Sie können damit das Functional DoE-Tool in JMP Pro vorführen. Die beigefügte Datentabelle enthält gespeicherte Skripte für jede Phase des Prozesses. Alternativ können Sie den unten aufgeführten Fallstudiendetails folgen, um die Arbeit neu zu erstellen.
- Sie können damit die Möglichkeit demonstrieren, die Datenpräsentation in der Functional Data Explorer-Plattform zu vereinfachen.
Welche Plattformen können wir nutzen?
- Graph Builder
- Funktionsdaten-Explorer
Hintergrund
Sophorolipid-Biotenside werden durch Fermentation einer Hefe mit Zucker, Öl und Stickstoff hergestellt, die aus einem hydrophilen Kopf und einem hydrophoben Schwanz bestehen. Wie bei vielen Bioprodukten gibt es in einer einzelnen Fermentation eine enorme Variation dieser Strukturen in Bezug auf chemische Bindungen, Kettenlänge und funktionelle Gruppen (um nur einige zu nennen). Für analytische Wissenschaftler stellt dies eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, diese Verbindungen effizient zu trennen, wenn analytische Werkzeuge wie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zum Einsatz kommen.
In dieser Fallstudie stand ich vor der Herausforderung, eine Methode zu entwickeln, mit der Sophorolipid-Biotenside mit HPLC-UV quantifiziert werden können, was bisher noch nicht möglich war. Leider war meine ursprüngliche Methode nicht in der Lage, zwei Sophorolipid-Kongenere (C18:1 und C17:1) mittels HPLC voneinander zu trennen. Sie unterschieden sich nur durch einen Kohlenstoff, was bedeutet, dass sie eine ähnliche Absorption (die Wellenlänge des Lichts, die sie absorbieren) und Retentionszeit (die Zeit, die sie in einem HPLC-Spektrum erscheinen) aufwiesen. Ich konnte nichts tun, um die Absorption zu ändern, aber ich könnte meine HPLC-Methode anpassen, um die Retentionszeit der beiden Produkte zu ändern, damit sie sich besser trennen. Die Peaktrennung ist in der Analytik von entscheidender Bedeutung, da die Peakfläche zur Berechnung der Konzentration einer bestimmten Verbindung verwendet wird. Ohne „eigenständige“ Peaks ist diese Berechnung von Natur aus fehlerhaft und kann zu ungenauen Messwerten führen. Das hier beschriebene Beispiel stellt eine häufige Herausforderung in der Analytik dar und ist für eine Vielzahl von Industrie- und Forschungsgruppen relevant.
Ziele
- Zur Optimierung der HPLC-Einstellungen, um die Peaks C18:1 und C17:1 effektiv zu trennen
- Stellen Sie sicher, dass die Peaks empfindlich (kein großer Verlust der Peakhöhe) und spezifisch (keine breiten Peaks) sind.
Methodenentwicklung – Erstanwendung des DoE
Um die HPLC-Methode zu optimieren, habe ich ein einfaches DoE angewendet, das die Temperatur (30, 35 und 40 ° C) und die Flussrate (0,7 und 1,4 ml/min) der Methode anpasste. In jeder Iteration wurde die gleiche Konzentration der Sophorolipidprobe getestet und alle anderen Bedingungen wurden durchgehend konstant gehalten.
Die Ausgabe für die HPLC ist ein Chromatogramm – dieses misst die Absorptionsintensität bei einer Wellenlänge (198 nm) über die Zeit, jeder Peak stellt eine Verbindung dar, die aus der HPLC austritt und auf den Detektor trifft – je länger jede Verbindung mit der HPLC-Säule interagiert, desto länger benötigt, um den Detektor zu erreichen, was zu einer späteren Retentionszeit führt. Die meisten Proben, die einer HPLC unterzogen werden, enthalten Hunderte von Verbindungen (einschließlich Ihrer interessierenden Verbindung), wodurch ein sehr umfangreiches Diagramm entsteht, das es unmöglich macht, die spezifischen Unterschiede zwischen den einzelnen Einstellungen mit dem bloßen Auge zu erkennen.
Erschwerend kam hinzu, dass die Änderung der Einstellungen (insbesondere der Durchflussrate) dazu führte, dass unser interessierender Peak (für die Formen C18:1 und C17:1) nicht die gleiche Retentionszeit aufwies. Dies macht es nicht nur schwierig, Ihren Höhepunkt herauszusuchen, sondern macht es auch sehr schwierig, bei zahlreichen Läufen eine Vergleichsgrafik zu erstellen, ohne dass die Grafik zu kompliziert wird.
Anwendung des Functional Data Explorer und des FDoE-Tools
Um die Änderungen am Chromatogramm zu untersuchen, wurde das Functional Data Explorer-Tool verwendet (Analysieren > Spezialisierte Modellierung > Functional Data Explorer). Die Einstellungen wurden wie oben übernommen.
Der ursprüngliche Datensatz zeigte das gesamte Chromatogramm, das sehr ausgelastet ist, während der interessierende Bereich in den C18:1- und C17:1-Peaks lag, die zwischen 22 und 30 Minuten auftraten. Der Zeitbereich wurde mithilfe des Tools „Befehle > Filter X“ von 22–30 Minuten reduziert.
Um im Vergleich aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, mussten die getrennten Peaks (verändert aufgrund der Änderung der Durchflussrate) ausgerichtet werden. Da die interessierenden Peaks die größte Intensität im interessierenden Bereich aufwiesen (wie es typischerweise bei der HPLC für bestimmte Verbindungen der Fall ist), war dies einfach mit dem Werkzeug „Ausrichten“ > „Maximum ausrichten“ möglich. Ein weiterer Filter X wurde verwendet, um den Bereich auf den interessierenden Peak zu reduzieren (-1 bis +1 Ausrichtungszeit). Peak-Alignment wird häufig in der Analytik eingesetzt – insbesondere bei der Entwicklung von LC-MS- und HPLC-Prozessen, und die einfache Anwendung mit dem FDE-Tool ist für Analytiker sehr nützlich.
Nachdem die Daten nun zur Analyse bereit waren, wurde ein Wavelet-Modell (Dropdown > Modelle > Wavelets) angewendet, da dieses am besten zu den chromatographischen Daten passte. Um die Auswirkung von Änderungen der Temperatur und Durchflussrate profilieren zu können, wurde das Wavelet DoE (Dropdown > Wavelets DoE Analysis) zur Profilierung des Chromatogramms verwendet.
Betrachtet man die Änderung der Durchflussrate (links), zeigt der FDoE-Profiler leicht, wie die Änderung der Durchflussrate zu einer Verschärfung des Peaks (angezeigt durch die Erhöhung des Peak-Intensitätswerts) und zum Auftreten eines zweiten Peaks (C17: 1 Verbindung). Darüber hinaus verbesserten die Temperaturänderungen (rechts) diese Trennung und Schärfung des Peaks weiter. Anhand dieses Profilers wurde deutlich, dass sich die Peaks zwar trennten, jedoch nicht ausreichend – dies deutete darauf hin, dass weitere Versuchsläufe erforderlich waren.
Weitere Läufe
Ausgehend von der Ausgabe des Wavelet-Funktions-DoE-Profilers wurden vier zusätzliche Läufe durchgeführt – zwei mit erhöhter Temperatur (45 und 50 ° C) und zwei mit erhöhter Durchflussrate und Temperatur (45 ° C, 1,6 und 1,8 ml/min). Die chromatographischen Daten wurden zum vorherigen Datensatz hinzugefügt und das Functional Data Explorer-Tool verwendet, um wie oben beschrieben einen Wavelet DoE-Profiler zu erstellen.
Der FDoE/Wavelet-Profiler konnte nachweisen, dass die Flussrate zu sinkenden Erträgen für die HPLC führte – sie verbesserte die Peaktrennung bei höheren Flussraten nicht wesentlich und führte zu einer Verringerung der Peakhöhe (was eine verringerte Empfindlichkeit bedeutet). Da es keine signifikante Verbesserung der Trennung gab, wurde die Flussrate bei 1,4 ml/min gehalten, um die Säule aufrechtzuerhalten (höhere Flussraten können sich nachteilig auf HPLCs auswirken, sodass hierdurch Risiko und Nutzen ausgeglichen werden konnten).
Bei der Betrachtung der Temperatur konnte der Profiler deutliche Verbesserungen sowohl bei der Peakhöhe (Verbesserung der Empfindlichkeit) als auch bei der Trennung des zweiten Peaks feststellen
Warum ist das wichtig?
Aus Kundensicht lässt sich der Bedarf an FDE und FDoE durch eine einfache Frage erklären:
Möchten Sie lieber versuchen, die Unterschiede damit zu erklären?
Oder dieses?
Der Einsatz der FDE-Plattform kann zu erheblichen Zeiteinsparungen führen, die Ergebnisproduktion optimieren und einfachere Diskussionen mit Nicht-KMU bei der Besprechung Ihrer Ergebnisse ermöglichen. Wenn dies mit FDoE verknüpft wird, erhalten Sie ein leistungsstarkes Tool, das die gesamte Änderung in Funktionsdaten/Profilen identifizieren kann, anstatt einzelne Punkte (z. B. Peakfläche in einer HPLC, Peakretentionszeit) zu verwenden. Die hier vorliegende Fallstudie demonstriert den Einsatz von FDE als Grundlage für die Entwicklung der HPLC-Methode zur Erstellung einer optimierten Methode.
Update (06.01.22): Hinzufügen einer Zielfunktion (Datenbank aktualisiert)
Ich habe das FDE-Modell aktualisiert, um eine Zielfunktion für die HPLC-Methode einzuschließen. Diese kann unter Datenverarbeitung > Zielfunktionen hochgeladen werden. Das Ziel besteht darin, vollständig getrennte Peaks (mit einer Intensität von 0 auf beiden Seiten) zu haben, sodass immer noch ein hoher, scharfer Peak erhalten bleibt. Beachten Sie, dass das Ziel nicht mit einer zeitlich ausgerichteten X-Achse geschrieben werden musste: Alle Verarbeitungsschritte ändern auch das Ziel.
Der Profiler enthält jetzt eine Schaltfläche „Ziel optimieren“, die die Temperatur- und Durchflussrateneinstellungen findet, mit denen das Profil am nächsten zum Ziel erreicht wird.
Aktualisieren(14. März 23): So bauen Sie ein Ziel
Im beigefügten Datensatz „Beispiel für die Erstellung eines Ziels – HPLC.jmp“ habe ich eine HPLC-Kurve erstellt, die „nahe“ an meinen Wünschen liegt, aber meine Ziele nicht ganz erreicht hat (vollständige Trennung der Peaks, schärfere Peaks) – Ich kann diesen Datensatz verwenden und die Datenpunkte auswählen, die ich ändern möchte. Im Beispiel habe ich:
1. Die Datenpunkte im Tiefpunkt zwischen den beiden Spitzen ausgewählt und auf Null gesetzt
2. Die Anzahl der Datenpunkte an der Spitze der Peaks wurde entfernt, um einen „schärferen“ Peak zu gewährleisten
3. Die Datenpunkte, die bei jedem Peak nach oben und unten verlaufen, wurden entfernt.
Anschließend habe ich das Spline-Tool verwendet und den Lambda-Wert angepasst, um die Kurve zu erhalten, die am besten zu meinen Daten passt. Ich habe festgestellt, dass dies bei den Kunden großen Anklang findet, daher lohnt es sich zu zeigen, wie das Lambda die Form verändert. Anschließend speichere ich die Spline-Werte mit „Formel speichern“ und kopiere sie dann als Ziel in die Datenbank.
Hallo @Joseph_Reese , danke für die Kommentare, ich freue mich, dass Ihnen das Beispiel gefallen hat.
– Ich würde dies gerne als Blog-Beitrag für die breitere Community veröffentlichen – wahrscheinlich als kurzes Video für FDE
– Ich gehe davon aus, dass Ihr Kunde, wenn er sich auf die Reduzierung von Verunreinigungen bezieht, davon spricht, diese im Chromatogramm von den interessierenden Peaks zu trennen. In diesem Fall würde ich vorschlagen, dass sie einen zweistufigen Prozess durchführen:
A) Führen Sie ihre DOEs (oder andere experimentelle Batch-Daten) wie geplant durch und identifizieren Sie die besten Einstellungen anhand ihres tatsächlichen Datensatzes (dies kann vom DOE-Profiler mitgeteilt werden).
Nehmen Sie dieses Zielprofil und passen Sie es entsprechend ihren Anforderungen an. Im Originalartikel habe ich ein Beispiel angehängt, wie ich hier die Zielkurven zusammenstelle – in diesem Beispiel habe ich eine „gute“ Kurve aus meinen Läufen genommen und sie angepasst, um sicherzustellen, dass zwischen den Spitzen eine deutliche Lücke besteht (Null). Intensität auf beiden Seiten) und passte die Breite der Spitzen an ihrer Spitze an. Sie können das Spline-Tool im Graph Builder verwenden, um eine geglättete Formel zu erstellen, die Sie dann als Ziel in Ihre ursprüngliche Datentabelle zurückbringen können (wenn Sie das Lambda ändern, erhalten Sie die benötigte Anpassung).
- Bei Zielkurven kommt es im Moment wirklich auf die manuelle Manipulation an – die oben beschriebene Methode funktioniert gut, basiert aber auf der Manipulation aktueller Daten. Ein Add-In zum Zeichnen Ihres gewünschten Diagramms wäre fantastisch. Was ich den Kunden gesagt habe, ist, dass das Ziel nicht immer perfekt sein muss – in diesem Fall hätte ich einfach zwei grobe „Dreiecke“ nebeneinander verwenden können, um die Spitzen darzustellen – das Modell würde trotzdem sein Bestes geben um die Einstellungen zu optimieren.
- Aus den verschiedenen Datensätzen, die ich getestet habe, ist die Art der Kurven, die in den FDOE-Diagnosediagrammen zu sehen sind, ziemlich normal. Die schlimmsten Übeltäter sind oft die Einstellungen am Rande des Designs. In diesem Beispiel liegen die roten Werte am Rand meines Designs und sind nicht in einem „geraden“ Designraum enthalten. Weitere Replikate würden auch dazu beitragen, dies zu verbessern.
Hallo @Bingh94 , DANKE für diesen tollen Beitrag! Es ist für mich sehr aktuell, da ich gerade gefragt wurde, wie FDE verwendet werden könnte, um Verunreinigungen in HPLC-Assays zu minimieren. Ich hatte beim Durchlesen ein paar Fragen und Kommentare und würde mich über jedes Feedback freuen!
- Kann dies ein eigener Blogbeitrag oder eine kurze Videodemo sein? Das liest sich wie etwas, das bereits für ein externes Publikum geeignet ist, und je mehr FDE-Beispiele es gibt, desto besser!
- Wenn Sie sich im Beispiel meines Kunden auf die Reduzierung von Verunreinigungen konzentrieren würden, wäre eine Zielkurve der beste Weg? Oder wäre es besser, den FDOE-Profiler und die Erwünschtheitseinstellungen zu verwenden, um bestimmte Spitzen zu minimieren?
- Apropos Zielkurven: Gibt es für unsere Kunden eine einfache Möglichkeit, Zielkurven zu erstellen, oder machen die meisten Leute dies manuell, indem sie versuchen, einen Datensatz einzugeben, der zu ihrem beabsichtigten Profil passt?Denken Sie darüber nach, wie ein Add-In vielleicht dabei helfen könnte, einen Datensatz zu erstellen, der auf der Zeichnung in einem Diagramm basiert, oder die vorhandenen Kurven irgendwie zu modifizieren, ähnlich wie wir mit Erwünschtheitskurven interagieren?
- Letzte Frage ... in Ihrem Beispiel zeigen die FDOE-Diagnosediagramme einige ungewöhnliche Muster. Wie besorgt sollten wir uns darüber sein und würde die Lösung dieses Problems die Einführung zusätzlicher GenReg-Modelle erfordern oder wäre dies ein Hinweis darauf, dass wir mehr Daten benötigen?
Nochmals vielen Dank für die tolle Arbeit hier!
