Hallo zusammen, mein Name ist Ben und ich bin vor kurzem als Praktikant zu JMP gekommen, der sich auf die Entwicklung von Inhalten für die Functional Data Explorer-Plattform konzentriert, die in JMP Pro 17 verfügbar ist (Sie können mehr über mich lesen hier ). Ich studiere derzeit meinen PhD in Chemieingenieurwesen an der University of Manchester mit Schwerpunkt auf der Herstellung von Sophorolipid-Biotensiden. Dies hat mir viele Einblicke in die potenziellen Daten/Anforderungen für die Verarbeitung von Daten in den frühen Phasen der Entwicklung von Bioprodukten gegeben. Die Fallstudie hier beschreibt meine Arbeit bei der Entwicklung einer analytischen Methode zum korrekten Nachweis von Sophorolipid-Biotensiden, wobei funktionelle Datenanalyse und funktionelles DoE verwendet werden, um mein experimentelles Protokoll zu leiten.
Was gefällt Ihnen an dieser Fallstudie?
- Es verwendet funktionale Datenanalyse und FDoE – kann beide Hauptkomponenten des Functional Data Explorer-Tools anzeigen
- Der Datensatz ist real und basiert auf tatsächlicher Entwicklungsarbeit
- Sie können sehr überzeugende Bilder zeigen – „Wow“-Faktor.
- Sie können die FDE-Plattform für eine einfache Vorverarbeitung (Ausrichtung, Filterung) verwenden.
Für wen ist das?
- Jeder, der an der analytischen Entwicklung beteiligt ist – einschließlich der chemischen, biologischen und pharmazeutischen Industrie.
- Jeder aus der Forschung und Entwicklung sollte in der Lage sein, zu sehen, wie es auf seine Situation übertragen werden könnte.
Wie sollte ich es verwenden?
- Sie können es verwenden, um das Functional DoE-Tool in JMP Pro zu demonstrieren. Die beigefügte Datentabelle enthält gespeicherte Skripte für jede Phase des Prozesses oder Sie können den Fallstudiendetails unten folgen, um die Arbeit neu zu erstellen.
- Sie können es verwenden, um die Möglichkeit zu zeigen, die Datenpräsentation in der Functional Data Explorer-Plattform zu vereinfachen.
Welche Plattformen können wir nutzen?
- Graph-Generator
- Funktionaler Daten-Explorer
Hintergrund
Sophorolipid-Biotenside werden durch die Fermentation einer Hefe mit Zucker, Öl und Stickstoff hergestellt, die aus einem hydrophilen Kopf und einem hydrophoben Schwanz bestehen. Wie bei vielen Bioprodukten gibt es bei diesen Strukturen in einer einzigen Fermentation massive Variationen in Bezug auf chemische Bindungen, Kettenlänge und funktionelle Gruppen (um nur einige zu nennen). Für Analytiker stellt dies eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, diese Verbindungen effizient zu trennen, wenn Analysewerkzeuge wie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendet werden.
In dieser Fallstudie stand ich vor der Herausforderung, eine Methode zu entwickeln, die in der Lage ist, Sophorolipid-Biotenside mit HPLC-UV zu quantifizieren, was zuvor noch nicht geschehen war. Leider war meine ursprüngliche Methode nicht in der Lage, zwei Sophorolipid-Kongenere (C18:1 und C17:1) mit HPLC voneinander zu trennen. Sie unterschieden sich nur durch einen Kohlenstoff, was bedeutet, dass sie eine ähnliche Absorption (die Wellenlänge des Lichts, die sie absorbieren) und eine ähnliche Retentionszeit (die Zeit, zu der sie in einem HPLC-Spektrum erscheinen) aufwiesen. Ich konnte nichts tun, um die Extinktion zu ändern, aber ich konnte meine HPLC-Methode anpassen, um die Retentionszeit der beiden Produkte zu ändern, damit sie sich besser trennen. Die Peaktrennung ist in der Analytik von entscheidender Bedeutung, da die Peakfläche zur Berechnung der Konzentration einer bestimmten Verbindung verwendet wird – ohne „eigenständige“ Peaks ist diese Berechnung von Natur aus fehlerhaft und kann zu ungenauen Messwerten führen. Das hier beschriebene Beispiel stellt eine gängige Herausforderung in der Analytik dar und hat Relevanz für verschiedenste Industrie- und Forschungsgruppen.
Ziele
- Zur Optimierung der HPLC-Einstellungen, um die C18:1- und C17:1-Peaks effektiv zu trennen
- Stellen Sie sicher, dass die Peaks empfindlich (kein großer Verlust an Peakhöhe) und spezifisch (keine breiten Peaks) sind.
Methodenentwicklung – Erste DoE-Anwendung
Um die HPLC-Methode zu optimieren, habe ich ein einfaches DoE angewendet, das die Temperatur angepasst hat (30, 35 und 40 Ö C) und Flussrate (0,7 und 1,4 ml/min) der Methode. Die gleiche Konzentration der Sophorolipidprobe wurde in jeder Iteration getestet und alle anderen Bedingungen wurden durchgehend konstant gehalten.
Die Ausgabe für die HPLC ist ein Chromatogramm – dies misst die Intensität der Absorption bei einer Wellenlänge (198 nm) über die Zeit, jeder Peak stellt eine Verbindung dar, die von der HPLC kommt und auf den Detektor trifft – je länger jede Verbindung mit der HPLC-Säule interagiert, desto länger ist sie benötigt, um den Detektor zu erreichen, was zu einer späteren Verweilzeit führt. Die meisten Proben, die auf HPLCs gegeben werden, enthalten Hunderte von Verbindungen (einschließlich Ihrer interessierenden Verbindung), die a sehr geschäftige Grafik, die es unmöglich macht, die spezifischen Unterschiede zwischen den einzelnen Einstellungen mit dem Auge zu erkennen.
Um die Sache noch komplizierter zu machen, bedeutete die Änderung der Einstellungen (insbesondere der Flussrate), dass unser Peak of Interest (für die C18:1- und C17:1-Formen) nicht die gleiche Retentionszeit hatte. Dies macht es nicht nur schwierig, Ihren Spitzenwert herauszusuchen, es macht es auch sehr schwierig, ein Vergleichsdiagramm zu erstellen, wenn Sie zahlreiche Läufe haben, ohne dass das Diagramm zu kompliziert wird.
Anwendung des Functional Data Explorer und FDoE-Tools
Um die Änderungen am Chromatogramm zu untersuchen, wurde das Tool Functional Data Explorer angewendet (Analyze > Specialized Modeling > Functional Data Explorer). Die Einstellungen wurden wie oben angewendet.
Der anfängliche Datensatz zeigte das gesamte Chromatogramm, das sehr beschäftigt ist, während der interessierende Bereich in den C18:1- und C17:1-Peaks lag, die zwischen 22 und 30 Minuten auftraten. Der Zeitbereich wurde mit der von 22-30 Minuten reduziert Befehle>Filter X Werkzeug.
Um einen aussagekräftigen Vergleich zu erhalten, mussten die getrennten Peaks (verändert durch die Änderung der Durchflussrate) ausgerichtet werden. Da die interessierenden Peaks die größte Intensität im interessierenden Bereich aufwiesen (wie es typischerweise bei HPLC für bestimmte Verbindungen der Fall ist), war dies mit dem einfach zu bewerkstelligen Ausrichten>Maximum ausrichten Werkzeug. Andere X filtern wurde verwendet, um den Bereich nur auf den interessierenden Peak zu reduzieren (-1 bis +1 ausgerichtete Zeit). Peak-Alignment wird häufig in der Analytik verwendet – insbesondere in der LC-MS- und HPLC-Prozessentwicklung, und die einfache Anwendung mit dem FDE-Tool ist für Analytiker sehr nützlich.
Nun, da die Daten für die Analyse bereit waren, ein Wavelet-Modell (Dropdown > Modelle > Wavelets) wurde angewendet, da dies am besten zu den chromatographischen Daten passte. Um den Effekt der Temperatur- und Durchflussänderung profilieren zu können, verwendet das Wavelet DoE (Dropdown > Wavelets-DoE-Analyse) wurde verwendet, um das Chromatogramm zu profilieren.
Mit Blick auf die Änderung der Flussrate (links) demonstriert der FDoE-Profiler leicht, wie die Änderung der Flussrate eine Verschärfung des Peaks (gezeigt durch die Erhöhung des Peak-Intensitätswerts) und das Auftreten eines zweiten Peaks (der C17: 1 Verbindung). Darüber hinaus verbesserten die Temperaturänderungen (rechts) diese Trennung und Schärfung des Peaks weiter. Aus diesem Profiler wurde deutlich, dass sich die Spitzen aber trennten nicht ausreichend – dies deutete darauf hin, dass weitere Versuchsläufe erforderlich waren.
Weitere Läufe
Aus der Ausgabe des funktionellen Wavelet-DoE-Profilers wurden 4 zusätzliche Läufe durchgeführt – 2 bei erhöhter Temperatur (45 und 50 Ö C) und 2 mit erhöhter Strömungsgeschwindigkeit und Temperatur (45 Ö C, 1,6 und 1,8 ml/min). Die chromatographischen Daten wurden dem vorherigen Datensatz hinzugefügt und das Functional Data Explorer-Tool verwendet, um einen Wavelet-DoE-Profiler wie oben beschrieben zu erstellen.
Der FDoE/Wavelet-Profiler konnte zeigen, dass die Flussrate abnehmende Erträge für die HPLC hatte – er verbesserte die Peaktrennung bei höheren Flussraten nicht wesentlich und führte zu einer Verringerung der Peakhöhe (was eine verringerte Empfindlichkeit bedeutet). Da es keine signifikante Verbesserung bei der Trennung gab, wurde die Flussrate bei 1,4 ml/min gehalten, um die Säule aufrechtzuerhalten (höhere Flussraten können für HPLCs schädlich sein, so dass dies in der Lage war, Risiko und Ertrag auszugleichen).
Bei der Betrachtung der Temperatur konnte der Profiler signifikante Verbesserungen sowohl bei der Peakhöhe (Verbesserung der Empfindlichkeit) als auch bei der Trennung des zweiten Peaks zeigen
Warum ist das wichtig?
Aus Kundensicht lässt sich die Notwendigkeit von FDE und FDoE durch eine einfache Frage erklären:
Möchten Sie lieber versuchen, die Unterschiede damit zu erklären?
Oder dieses?
Die Verwendung der FDE-Plattform kann zu erheblichen Zeiteinsparungen führen, die Ergebniserstellung rationalisieren und einfachere Diskussionen mit Nicht-KMU ermöglichen, wenn Sie Ihre Ergebnisse diskutieren. Wenn dies in Tangente mit FDoE gestellt wird, erhalten Sie ein leistungsstarkes Tool, das die gesamte Änderung der funktionellen Daten/Profile identifizieren kann, anstatt einzelne Punkte zu verwenden (z. B. Peakfläche in einer HPLC, Peakretentionszeit). Die Fallstudie hier demonstriert die Verwendung von FDE, um die Entwicklung der HPLC-Methode zu informieren, um eine optimierte Methode zu produzieren.
