Bonjour à tous, je m'appelle Ben et j'ai récemment rejoint JMP en tant que stagiaire chargé de développer du contenu pour la plateforme Functional Data Explorer disponible dans JMP Pro 17 (vous pouvez en savoir plus sur moi ici ). J'étudie actuellement mon doctorat en génie chimique à l'Université de Manchester, avec une spécialisation sur la production de biosurfactants sophorolipides. Cela m'a donné beaucoup d'informations sur les données/besoins potentiels pour le traitement des données dans les premières étapes du développement des bioproduits. L'étude de cas décrit ici mon travail de développement d'une méthode analytique pour détecter correctement les biosurfactants sophorolipides, en utilisant l'analyse des données fonctionnelles et le DoE fonctionnel pour guider mon protocole expérimental.
Qu’est-ce qui vous plaît dans cette étude de cas ?
- Il utilise l'analyse des données fonctionnelles et FDoE – peut afficher les deux principaux composants de l'outil Functional Data Explorer
- L'ensemble de données est réel et basé sur un travail de développement réel
- Vous pouvez montrer des visuels très convaincants – facteur « wow ».
- Vous pouvez utiliser la plateforme FDE pour effectuer facilement un prétraitement (alignement, filtrage)
C'est pour qui?
- Toute personne impliquée dans le développement analytique – y compris les industries chimiques, biologiques et pharmaceutiques.
- N'importe qui en R&D devrait être en mesure de voir comment cela pourrait se traduire dans sa situation.
Comment dois-je l’utiliser ?
- Vous pouvez l'utiliser pour faire une démonstration de l'outil Functional DoE dans JMP Pro. Le tableau de données ci-joint contient des scripts enregistrés pour chaque étape du processus. Vous pouvez également suivre les détails de l'étude de cas ci-dessous pour recréer le travail.
- Vous pouvez l'utiliser pour montrer la capacité de simplifier la présentation des données dans la plateforme Functional Data Explorer.
Quelles plateformes pouvons-nous utiliser ?
- Générateur de graphiques
- Explorateur de données fonctionnelles
Arrière-plan
Les biosurfactants sophorolipides sont produits par la fermentation d'une levure avec du sucre, de l'huile et de l'azote composés d'une tête hydrophile et d'une queue hydrophobe. Comme pour de nombreux bioproduits, ces structures varient énormément au cours d’une seule fermentation en termes de liaisons chimiques, de longueur de chaîne et de groupes fonctionnels (pour n’en nommer que quelques-uns). Pour les analystes, cela représente un défi en termes de séparation efficace de ces composés lors de l'utilisation d'outils analytiques tels que la chromatographie liquide haute performance (HPLC).
Dans cette étude de cas, j'ai été confronté au défi d'essayer de produire une méthode capable de quantifier les biosurfactants sophorolipides par HPLC-UV, ce qui n'avait pas été fait auparavant. Malheureusement, ma méthode initiale n’a pas permis de séparer deux congénères de sophorolipides (C18:1 et C17:1) d’un autre par HPLC. Ils ne différaient que par un carbone, ce qui signifie qu’ils avaient une absorbance (la longueur d’onde de la lumière qu’ils absorbent) et un temps de rétention (le temps pendant lequel ils apparaissent sur un spectre HPLC) similaires. Je ne pouvais rien faire pour modifier l'absorbance, mais je pouvais adapter ma méthode HPLC pour modifier le temps de rétention des deux produits afin qu'ils se séparent mieux. La séparation des pics est vitale en analyse, car la surface des pics est utilisée pour calculer la concentration d'un composé donné. Sans pics « autonomes », ce calcul est intrinsèquement erroné et peut conduire à des lectures inexactes. L'exemple décrit ici représente un défi courant en matière d'analyse et est pertinent pour une grande variété de groupes industriels et de recherche.
Objectifs
- Pour optimiser les paramètres HPLC afin de séparer efficacement les pics C18:1 et C17:1
- S'assurer que les pics sont sensibles (pas de perte majeure de hauteur de pic) et spécifiques (pas de pics larges)
Développement de méthodes – Application initiale du DoE
Pour optimiser la méthode HPLC, j'ai appliqué une DoE simple qui a adapté la température (30, 35 et 40 o C) et le débit (0,7 et 1,4 mL/min) de la méthode. La même concentration d’échantillon de sophorolipide a été testée à chaque itération et toutes les autres conditions sont restées constantes tout au long.
Le résultat de la HPLC est un chromatogramme – celui-ci mesure l'intensité de l'absorbance à une longueur d'onde (198 nm) au fil du temps, chaque pic représente un composé sortant de la HPLC et frappant le détecteur – plus chaque composé interagit longtemps avec la colonne HPLC, plus il reste longtemps. met pour atteindre le détecteur, provoquant un temps de rétention plus tardif. La plupart des échantillons placés sur HPLC contiennent des centaines de composés (y compris le composé qui vous intéresse) produisant un graphique très chargé qui rend impossible la distinction visuelle des différences spécifiques entre chaque paramètre.
Pour compliquer encore les choses, le changement de paramètres (notamment de débit) a fait que notre pic d'intérêt (pour les formes C18:1 et C17:1) n'avait pas le même temps de rétention. Cela rend non seulement difficile la détermination de votre pic, mais également la production d'un graphique de comparaison lorsque vous effectuez de nombreuses analyses sans que le graphique ne devienne trop compliqué.
Application de l'outil Functional Data Explorer et FDoE
Pour explorer les modifications apportées au chromatogramme, l'outil Functional Data Explorer a été appliqué (Analyse > Modélisation spécialisée > Functional Data Explorer). Les paramètres ont été appliqués comme ci-dessus.
L'ensemble de données initial montrait l'ensemble du chromatogramme qui est très chargé, alors que la région d'intérêt se situait dans les pics C18:1 et C17:1 qui se produisaient entre 22 et 30 minutes. La plage de temps a été réduite de 22 à 30 minutes à l’aide de l’outil Commandes> Filtre X.
Afin d'obtenir quelque chose de significatif dans la comparaison, les pics séparés (modifiés en raison du changement de débit) devaient être alignés. Comme les pics d'intérêt avaient la plus grande intensité dans la plage d'intérêt (comme c'est généralement le cas en HPLC pour des composés spécifiques), cela a été réalisé facilement avec l'outil Align>Align Maximum . Un autre filtre X a été utilisé pour réduire la plage au pic d'intérêt (temps d'alignement de -1 à +1). L'alignement des pics est beaucoup utilisé en analyse, en particulier dans le développement de processus LC-MS et HPLC, et la facilité de son application avec l'outil FDE est très utile pour les scientifiques analytiques.
Maintenant que les données étaient prêtes pour l'analyse, un modèle d'ondelettes (Dropdown > Modèles > Ondelettes) a été appliqué car il correspondait le mieux aux données chromatographiques. Pour pouvoir profiler l'effet du changement de température et de débit, le Wavelet DoE (Dropdown > Wavelets DoE Analysis) a été utilisé pour profiler le chromatogramme.
En regardant le changement de débit (à gauche), le profileur FDoE démontre facilement comment le changement de débit provoque une accentuation du pic (indiqué par l'augmentation de la valeur de l'intensité du pic) et l'apparition d'un deuxième pic (le C17 : 1 composé). De plus, les changements de température (à droite) ont encore amélioré cette séparation et cette netteté du pic. À partir de ce profileur, il est devenu clair que les pics se séparaient mais pas suffisamment – cela indiquait que davantage d’essais expérimentaux étaient nécessaires.
Autres courses
À partir des résultats du profileur DoE fonctionnel Wavelet, 4 analyses supplémentaires ont été effectuées : 2 avec une augmentation de la température (45 et 50 ° C) et 2 avec une augmentation du débit et de la température (45 ° C, 1,6 et 1,8 mL/min). Les données chromatographiques ont été ajoutées à l'ensemble de données précédent et l'outil Functional Data Explorer a été utilisé pour produire un profileur Wavelet DoE comme décrit ci-dessus.
Le profileur FDoE/Wavelet a pu démontrer que le débit avait des rendements décroissants pour la HPLC – il n’améliorait pas considérablement la séparation des pics à des débits plus élevés et conduisait à une diminution de la hauteur du pic (ce qui signifiait une sensibilité réduite). Comme il n'y a pas eu d'amélioration significative de la séparation, le débit a été maintenu à 1,4 ml/min afin de maintenir la colonne (des débits plus élevés peuvent être préjudiciables aux HPLC, ce qui a permis d'équilibrer le risque par rapport à la récompense).
En examinant la température, le profileur a pu montrer des améliorations significatives à la fois dans la hauteur du pic (amélioration de la sensibilité) et dans la séparation du deuxième pic.
Pourquoi est-ce important ?
Du point de vue des clients, la nécessité de FDE et FDoE peut s’expliquer par une question simple :
Préféreriez-vous essayer d'expliquer les différences avec ceci ?
Ou ca?
L'utilisation de la plateforme FDE peut permettre un gain de temps significatif, rationaliser la production des résultats et permettre des discussions plus faciles avec des non-PME lors de l'examen de vos résultats. Lorsque cela est placé en tangente avec FDoE, vous obtenez un outil puissant qui peut identifier l'ensemble du changement dans les données/profils fonctionnels, plutôt que d'utiliser des points uniques (c'est-à-dire la surface maximale dans une HPLC, le temps de rétention maximal). L'étude de cas ici démontre l'utilisation de FDE pour éclairer le développement de la méthode HPLC afin de produire une méthode optimisée.
Mise à jour (06 janvier 22) : Ajout d'une fonction cible (base de données mise à jour)
J'ai mis à jour le modèle FDE pour inclure une fonction Target pour la méthode HPLC. Cela peut être téléchargé sous Traitement des données > Fonctions cibles. L'objectif vise à avoir des pics complètement séparés (avec une intensité nulle de chaque côté) tout en conservant un pic haut et pointu. Notez qu'il n'est pas nécessaire que la cible soit écrite avec un axe x « temps aligné » : toutes les étapes de traitement modifieront également la cible.
Le profileur contient désormais un bouton « Optimiser la cible » qui trouvera les paramètres de température et de débit permettant d'obtenir le profil le plus proche de la cible.
Mise à jour(14 mars 23) : Comment construire une cible
Dans l'ensemble de données ci-joint "Exemple de construction d'une cible - HPLC.jmp", j'ai pris une courbe HPLC qui est "proche" de ce que je désire mais qui n'a pas tout à fait atteint mes objectifs (séparation complète des pics, pics plus nets) - Je peux utiliser cet ensemble de données et sélectionner les points de données que je souhaite modifier. Dans l'exemple, je :
1. Sélectionnez les points de données dans le creux entre les deux pics et changez-les à zéro
2. Suppression du nombre de points de données à la pointe des pics pour garantir un pic « plus net »
3. Suppression des points de données montant et descendant à chaque pic.
J'ai ensuite utilisé l'outil spline et ajusté la valeur lambda pour obtenir la courbe la mieux ajustée pour mes données. J'ai trouvé que cela résonne vraiment auprès des clients, cela vaut donc la peine de montrer comment le lambda change de forme. J'utilise ensuite « Enregistrer la formule » pour enregistrer les valeurs de spline, puis je les copie en tant que cible dans la base de données.
Salut @Joseph_Reese , merci pour les commentaires, heureux que vous ayez aimé l'exemple.
- Je serais heureux de publier ceci sous forme d'article de blog pour la communauté au sens large - probablement sous forme de courte vidéo pour FDE
- Je suppose que lorsque votre client fait référence à la réduction des impuretés, il parle de les séparer sur le chromatogramme de ses pics d'intérêt. Dans ce cas, je leur suggérerais de suivre un processus en deux étapes :
A) Exécutez leurs DOE (ou d'autres données de lots expérimentaux) comme prévu et identifiez les meilleurs paramètres dont ils disposent grâce à leur ensemble de données réel (cela peut être informé par le profileur DOE)
Prenez ce profil cible et ajustez-le en fonction de ses besoins. J'ai joint un exemple dans l'article original sur la façon dont j'ai rassemblé les courbes cibles ici - dans cet exemple, j'ai pris une "bonne" courbe de mes courses et je l'ai ajustée pour m'assurer que les pics avaient un écart distinct entre chacun (zéro intensité de chaque côté) et ajusté la largeur des pics à leur extrémité. Vous pouvez utiliser l'outil spline dans Graph Builder pour créer une formule lissée que vous pouvez ensuite réintégrer dans votre table de données d'origine en tant que cible (si vous modifiez le Lambda, vous pouvez obtenir l'ajustement dont vous avez besoin).
- Pour les courbes cibles, cela se résume pour le moment à une manipulation manuelle - la méthode que j'ai décrite ci-dessus fonctionne bien mais repose sur la manipulation des données actuelles. Un complément pour dessiner le graphique souhaité serait incroyable. Ce que j'ai dit aux clients, c'est que la cible ne doit pas toujours être parfaite - dans ce cas, j'aurais pu simplement utiliser deux "triangles" bruts placés l'un à côté de l'autre pour représenter les sommets - le modèle ferait toujours de son mieux. pour optimiser les réglages.
- D'après les différents ensembles de données que j'ai testés, le type de courbes observées dans les tracés de diagnostic FDOE est assez normal - la plupart du temps, les pires coupables sont les paramètres qui se trouvent à la limite de la conception. Dans cet exemple, les valeurs rouges se trouvent à la limite de ma conception et ne sont pas contenues dans un espace de conception « pair ». Un plus grand nombre de répétitions contribuerait également à améliorer cela.
Salut @Bingh94 , MERCI pour cet excellent article ! C'est très opportun pour moi car on vient de me demander comment le FDE pourrait être utilisé pour minimiser les impuretés dans les tests HPLC. J'ai eu quelques questions et commentaires en lisant ceci et j'apprécierais vos commentaires !
- Peut-il s'agir de son propre article de blog ou d'une courte démo vidéo ? Cela ressemble à quelque chose qui convient déjà à un public externe et plus il y a d'exemples FDE, mieux c'est !
- Dans l'exemple de mon client, si vous vous concentriez sur la réduction des impuretés, une courbe cible serait-elle la meilleure solution ? Ou serait-il préférable d'utiliser le profileur FDOE et les paramètres de désirabilité pour minimiser certains pics ?
- En ce qui concerne les courbes cibles, existe-t-il un moyen simple pour nos clients de créer des courbes cibles ou la plupart des gens le font-ils manuellement en essayant de saisir un ensemble de données qui correspond à leur profil prévu ?Vous réfléchissez à la manière dont un complément pourrait peut-être aider à créer un ensemble de données basé sur le dessin sur un graphique ou à modifier d'une manière ou d'une autre les courbes existantes de la même manière que nous interagissons avec les courbes de désirabilité ?
- Dernière question... dans votre exemple, les tracés de diagnostic FDOE montrent quelques modèles inhabituels. Dans quelle mesure devrions-nous nous en préoccuper et résoudre ce problème impliquerait-il d'adapter des modèles GenReg supplémentaires ou cela serait-il une indication que nous avons besoin de plus de données ?
Merci encore pour l'excellent travail ici!
