Bonjour à tous, je m'appelle Ben et j'ai récemment rejoint JMP en tant que stagiaire spécialisé dans le développement de contenu pour la plate-forme Functional Data Explorer disponible dans JMP Pro 17 (vous pouvez en savoir plus sur moi ici ). J'étudie actuellement mon doctorat en génie chimique à l'Université de Manchester avec un accent sur la production de biosurfactants sophorolipides. Cela m'a donné beaucoup d'informations sur les données/besoins potentiels pour le traitement des données dans les premières étapes du développement des bioproduits. L'étude de cas ici décrit mon travail dans le développement d'une méthode analytique pour détecter correctement les biosurfactants sophorolipides, en utilisant l'analyse de données fonctionnelles et le DoE fonctionnel pour guider mon protocole expérimental.
Qu'est-ce qui vous plaît dans cette étude de cas ?
- Il utilise l'analyse des données fonctionnelles et FDoE - peut afficher les deux principaux composants de l'outil Functional Data Explorer
- L'ensemble de données est réel et basé sur un travail de développement réel
- Vous pouvez montrer des visuels très convaincants - facteur "wow".
- Vous pouvez utiliser la plate-forme FDE pour effectuer facilement un prétraitement (alignement, filtrage)
C'est pour qui?
- Toute personne impliquée dans le développement analytique - y compris les industries chimiques, biologiques et pharmaceutiques.
- Toute personne de la R&D devrait être en mesure de voir comment cela pourrait se traduire dans sa situation.
Comment dois-je l'utiliser ?
- Vous pouvez l'utiliser pour faire une démonstration de l'outil DoE fonctionnel dans JMP Pro. Le tableau de données ci-joint contient des scripts enregistrés pour chaque étape du processus ou vous pouvez suivre les détails de l'étude de cas ci-dessous pour recréer le travail.
- Vous pouvez l'utiliser pour montrer la possibilité de simplifier la présentation des données dans la plate-forme Functional Data Explorer.
Quelles plateformes pouvons-nous utiliser ?
- Générateur de graphiques
- Explorateur de données fonctionnelles
Fond
Les biotensioactifs sophorolipidiques sont produits par la fermentation d'une levure avec du sucre, de l'huile et de l'azote qui sont composés d'une tête hydrophile et d'une queue hydrophobe. Comme pour beaucoup de bioproduits, il existe une variation massive de ces structures dans une seule fermentation en termes de liaisons chimiques, de longueur de chaîne et de groupes fonctionnels (pour n'en nommer que quelques-uns). Pour les scientifiques analytiques, cela représente un défi en termes de séparation efficace de ces composés lors de l'utilisation d'outils analytiques tels que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
Dans cette étude de cas, j'ai été confronté au défi d'essayer de produire une méthode capable de quantifier les biosurfactants sophorolipides avec HPLC-UV, ce qui n'avait pas été fait auparavant. Malheureusement, ma méthode initiale n'a pas été en mesure de séparer deux congénères sophorolipides (C18:1 et C17:1) d'un autre avec HPLC. Ils ne différaient que par un seul carbone, ce qui signifie qu'ils avaient une absorbance (la longueur d'onde de la lumière qu'ils absorbent) et un temps de rétention (le temps d'apparition sur un spectre HPLC) similaires. Je ne pouvais rien faire pour modifier l'absorbance, mais je pouvais adapter ma méthode HPLC pour modifier le temps de rétention des deux produits afin qu'ils se séparent mieux. La séparation des pics est essentielle dans l'analyse car la surface du pic est utilisée pour calculer la concentration d'un composé donné - sans pics « autonomes », ce calcul est intrinsèquement erroné et peut conduire à des lectures inexactes. L'exemple décrit ici représente un défi commun dans le domaine de l'analyse et est pertinent pour une grande variété de groupes industriels et de recherche.
Objectifs
- Pour optimiser les paramètres HPLC afin de séparer efficacement les pics C18:1 et C17:1
- Assurez-vous que les pics sont sensibles (pas de perte majeure de hauteur de pic) et spécifiques (pas de pics larges)
Développement de méthodes - Application initiale du DoE
Pour optimiser la méthode HPLC, j'ai appliqué un DoE simple qui adaptait la température (30, 35 et 40 o C) et débit (0,7 et 1,4 ml/min) de la méthode. La même concentration d'échantillon de sophorolipides a été testée à chaque itération et toutes les autres conditions ont été maintenues constantes tout au long.
La sortie de la HPLC est un chromatogramme - cela mesure l'intensité de l'absorbance à une longueur d'onde (198 nm) au fil du temps, chaque pic représente un composé sortant de la HPLC et frappant le détecteur - plus chaque composé interagit avec la colonne HPLC, plus il est long prend pour atteindre le détecteur, provoquant un temps de rétention plus tard. La plupart des échantillons qui sont mis sur HPLC contiennent des centaines de composés (y compris votre composé d'intérêt) produisant un très graphique chargé qui rend impossible de discerner les différences spécifiques entre chaque paramètre à l'œil nu.
Pour compliquer encore les choses, le changement de paramètres (débit notamment) faisait que notre pic d'intérêt (pour les formes C18:1 et C17:1) n'avait pas le même temps de rétention. Cela rend non seulement difficile la sélection de votre pic, mais rend également très difficile la production d'un graphique de comparaison lorsque vous avez de nombreuses exécutions sans que le graphique ne devienne trop compliqué.
Application de l'outil Functional Data Explorer et FDoE
Pour explorer les modifications apportées au chromatogramme, l'outil Functional Data Explorer a été appliqué (Analyze > Specialized Modeling > Functional Data Explorer). Les paramètres ont été appliqués comme ci-dessus.
L'ensemble de données initial a montré tout le chromatogramme qui est très occupé, alors que la région d'intérêt se trouvait dans les pics C18:1 et C17:1 qui se sont produits entre 22 et 30 minutes. La plage de temps a été réduite de 22 à 30 minutes en utilisant le Commandes>Filtre X outil.
Afin d'obtenir quelque chose de significatif dans la comparaison, les pics séparés (modifiés en raison du changement de débit) devaient être alignés. Comme les pics d'intérêt avaient la plus grande intensité dans la plage d'intérêt (comme c'est généralement le cas en HPLC pour des composés spécifiques), cela a été fait facilement avec le Aligner>Aligner maximum outil. Une autre Filtre X a été utilisé pour réduire la plage au seul pic d'intérêt (-1 à +1 temps d'alignement). L'alignement des pics est beaucoup utilisé dans l'analyse - en particulier dans le développement de processus LC-MS et HPLC et la facilité de son application avec l'outil FDE est très utile pour les scientifiques analytiques.
Maintenant que les données étaient prêtes pour l'analyse, un modèle Wavelet (Liste déroulante > Modèles > Ondelettes) a été appliqué car cela correspondait le mieux aux données chromatographiques. Pour pouvoir profiler l'effet de la modification de la température et du débit, l'ondelette DoE (Liste déroulante > Analyse DoE des ondelettes) a été utilisé pour profiler le chromatogramme.
En regardant le changement de débit (à gauche), le profileur FDoE démontre facilement comment le changement de débit provoque une netteté du pic (indiqué par l'augmentation de la valeur d'intensité du pic) et l'apparition d'un deuxième pic (le C17 : 1 composé). De plus, les changements de température (à droite) ont encore amélioré cette séparation et l'accentuation du pic. À partir de ce profileur, il est devenu clair que les pics se séparaient mais pas suffisamment – cela indiquait que davantage d'essais expérimentaux étaient nécessaires.
Courses supplémentaires
À partir de la sortie du profileur DoE fonctionnel Wavelet, 4 exécutions supplémentaires ont été effectuées - 2 examinant une température accrue (45 et 50 o C) et 2 à débit augmenté et température (45 o C, 1,6 et 1,8 ml/min). Les données chromatographiques ont été ajoutées à l'ensemble de données précédent et l'outil Functional Data Explorer a été utilisé pour produire un profileur Wavelet DoE comme décrit ci-dessus.
Le profileur FDoE/Wavelet a pu démontrer que le débit avait des rendements décroissants pour la HPLC - il n'améliorait pas considérablement la séparation des pics à des débits plus élevés et entraînait une diminution de la hauteur du pic (ce qui signifie une sensibilité réduite). Comme il n'y a pas eu d'amélioration significative de la séparation, le débit a été maintenu à 1,4 ml/min afin de maintenir la colonne (des débits plus élevés peuvent être préjudiciables aux HPLC, ce qui a permis d'équilibrer le risque par rapport à la récompense).
En ce qui concerne la température, le profileur a pu montrer des améliorations significatives à la fois de la hauteur du pic (amélioration de la sensibilité) et de la séparation du deuxième pic
Pourquoi est-ce important ?
Du point de vue des clients, le besoin de FDE et FDoE peut être expliqué par une simple question :
Préférez-vous essayer d'expliquer les différences avec ceci?
Ou ca?
L'utilisation de la plate-forme FDE peut fournir des gains de temps significatifs, rationaliser la production de résultats et permettre des discussions plus faciles avec des non-PME lors de la discussion de vos résultats. Lorsque cela est placé en tangente avec FDoE, vous obtenez un outil puissant qui peut identifier l'ensemble du changement dans les données/profils fonctionnels, plutôt que d'utiliser des points uniques (c'est-à-dire la zone de pic dans une HPLC, le temps de rétention de pic). L'étude de cas ici démontre l'utilisation de FDE pour éclairer le développement de la méthode HPLC afin de produire une méthode optimisée.
