大家好，我叫 Ben，最近作為實習生加入 JMP，專注於為 JMP Pro 17 中提供的功能數據瀏覽器平台開發內容（您可以在此處閱讀有關我的更多信息）。我目前正在曼徹斯特大學攻讀化學工程博士學位，專注於槐醣脂生物表面活性劑的生產。這讓我對生物產品開發早期階段的潛在數據/處理數據的需求有了很多了解。這裡的案例研究描述了我開發一種分析方法來正確檢測槐醣脂生物界面活性劑的工作，使用功能性數據分析和功能性能源部來指導我的實驗方案。
您喜歡這個案例研究的哪些方面？
- 它使用功能數據分析和 FDoE – 可以顯示功能數據瀏覽器工具的兩個主要組件
- 數據集是真實的並且基於實際的開發工作
- 您可以展示非常引人注目的視覺效果 - “哇”因素。
- 您可以利用FDE平台輕鬆進行預處理（對齊、過濾）
它是給誰用的？
- 任何參與分析開發的人——包括化學、生物和製藥行業。
- 研發部門的任何人都應該能夠看到它如何轉化為他們的情況。
我應該如何使用它？
- 您可以使用它來演示 JMP Pro 中的功能 DoE 工具。隨附的資料表已保存流程每個階段的腳本，或者您可以按照下面的案例研究詳細資訊重新建立工作。
- 您可以使用它來展示簡化 Function Data Explorer 平台中的資料呈現的能力。
我們可以使用哪些平台？
背景
槐醣脂生物界面活性劑是透過酵母與糖、油和氮的發酵產生的，由親水頭和疏水尾組成。與許多生物產品一樣，單次發酵中這些結構在化學鍵、鍊長和官能基（僅舉幾例）方面存在巨大差異。對於分析科學家來說，在使用高效液相層析 (HPLC) 等分析工具時有效分離這些化合物提出了挑戰。
在本案例研究中，我面臨著嘗試開發一種能夠使用 HPLC-UV 定量槐醣脂生物表面活性劑的方法的挑戰，而此前尚未有人做過這種方法。不幸的是，我最初的方法無法透過 HPLC 將兩種槐醣脂同源物（C18:1 和 C17:1）與另一種分離。它們僅相差一個碳，這意味著它們具有相似的吸光度（它們吸收的光的波長）和保留時間（它們在 HPLC 光譜上出現的時間）。我無法做任何事情來改變吸光度，但我可以調整 HPLC 方法來改變兩種產品的保留時間，以便它們可以更好地分離。峰分離在分析中至關重要，因為峰面積用於計算給定化合物的濃度 - 如果沒有「獨立」峰，這種計算本質上是有缺陷的，可能導致讀數不準確。這裡描述的例子代表了分析中的一個常見挑戰，並且與各種工業和研究團體相關。
目標
- 優化 HPLC 設定以有效分離 C18:1 和 C17:1 峰
- 確保峰敏感（峰高無重大損失）和特異性（無寬峰）
方法開發 – 美國能源部初始申請
為了優化 HPLC 方法，我應用了一個簡單的 DoE，調整了該方法的溫度（30、35 和 40 o C）和流速（0.7 和 1.4 mL/min）。每次迭代都測試相同濃度的槐醣脂樣品，並且所有其他條件始終保持恆定。
HPLC 的輸出是色譜圖– 它測量波長(198 nm) 隨時間變化的吸光度強度，每個峰值代表從HPLC 出來並撞擊檢測器的化合物– 每種化合物與HPLC 色譜柱相互作用的時間越長，其作用時間越長到達偵測器所需的時間，導致保留時間較晚。大多數進行 HPLC 的樣品都包含數百種化合物（包括您感興趣的化合物），產生非常複雜的圖表，無法透過肉眼辨別每種設定之間的具體差異。
更複雜的是，設定的變化（特別是流速）意味著我們感興趣的峰值（對於 C18:1 和 C17:1 形式）沒有相同的保留時間。這不僅使得很難選擇峰值，而且當您進行多次運行而不使圖形變得過於複雜時，也很難產生比較圖。
Function Data Explorer 和 FDoE 工具的應用
為了探索色譜圖的變化，應用了功能性資料瀏覽器工具（分析 > 專業建模 > 功能資料瀏覽器）。如上所述應用設定。
初始資料集顯示所有非常繁忙的色譜圖，而感興趣的區域位於 22-30 分鐘之間出現的 C18:1 和 C17:1 峰。使用Commands>Filter X工具，時間範圍從 22-30 分鐘減少。
為了在比較中獲得任何有意義的信息，需要對齊分離的峰值（由於流速的變化而變化）。由於目標峰在目標範圍內具有最大強度（特定化合物的 HPLC 中通常會出現這種情況），因此可以使用Align>Align Maximum工具輕鬆完成此操作。另一個過濾器 X用於將範圍縮小到感興趣的峰值（-1 到 +1 對齊時間）。峰對齊在分析中被大量使用，特別是在 LC-MS 和 HPLC 製程開發中，並且透過 FDE 工具輕鬆應用它對於分析科學家來說非常有用。
現在資料已準備好進行分析，應用小波模型（下拉式選單 > 模型 > 小波），因為它最適合色譜資料。為了能夠分析改變溫度和流速的影響，使用小波 DoE （下拉式選單 > 小波 DoE 分析）來分析色譜圖。
查看流速的變化（左），FDoE 分析器可以輕鬆展示流速的變化如何導致峰值銳化（透過峰值強度值的增加顯示）以及第二個峰值（C17： 1 化合物）。除此之外，溫度的變化（右）進一步改善了峰的分離和銳化。從此分析儀中可以清楚地看出，峰值正在分離，但分離不充分——這表明需要進行更多的實驗運行。
進一步運行
根據 Wavelet 功能 DoE 分析器的輸出，執行了 4 次額外的運行 - 2 次觀察升高的溫度（45 和 50 o C），2 次觀察增加的流速和溫度（45 o C，1.6 和1.8 mL/ min）。色譜數據被添加到先前的數據集，並且功能數據瀏覽器工具用於生成小波 DoE 分析器，如上所述。
FDoE/小波分析儀能夠證明流速對 HPLC 的回報遞減 - 它在較高流速下並沒有大幅改善峰值分離，並導致峰值高度降低（意味著靈敏度降低）。由於分離效果沒有顯著改善，因此流速保持在 1.4mL/min 以維持色譜柱的運作（較高的流速可能對 HPLC 不利，因此這能夠平衡風險與回報）。
在觀察溫度時，輪廓儀能夠在峰值高度（提高靈敏度）和第二個峰值的分離方面顯示出顯著的改進
為什麼這很重要？
從客戶的角度來看，FDE 和 FDoE 的需求可以透過一個簡單的問題來解釋：
您願意嘗試解釋一下其中的差異嗎？
或這個？
使用 FDE 平台可以節省大量時間，簡化結果生成，並在討論結果時可以更輕鬆地與非中小企業進行討論。當它與 FDoE 相切時，您將獲得一個強大的工具，可以識別功能數據/配置文件的整體變化，而不是使用單點（即 HPLC 中的峰面積、峰保留時間）。這裡的案例研究展示瞭如何使用 FDE 來指導 HPLC 方法的開發，以產生最佳化的方法。
更新 (06Jan22)：新增目標函數（資料庫已更新）
我已更新 FDE 模型以包含 HPLC 方法的目標函數。這可以在資料處理 > 目標函數下上傳。目標是完全分離峰（兩側強度均為 0），同時仍保留高而尖銳的峰。請注意，目標不必以「對齊時間」x 軸寫入：所有處理步驟也會變更目標。
分析器現在包含一個「優化目標」按鈕，可以找到實現最接近目標的溫度和流速設定。
更新(14Mar23): 如何建立目標
在隨附的數據集“構建目標的示例- HPLC.jmp”中，我採用了一條HPLC 曲線，該曲線“接近”我想要的，但尚未完全達到我的目標（峰完全分離，峰更尖銳）-我可以使用這個數據集並選擇我想要更改的數據點。在我的例子中：
1. 選擇兩個峰值之間的波谷中的資料點並將其變更為零
2. 刪除了峰尖處的資料點數量，以確保峰“更尖銳”
3. 刪除了每個峰值「上下」運行的資料點。
然後，我使用樣條工具並調整 lambda 值以獲得數據的最佳擬合曲線 - 我發現這確實引起了客戶的共鳴，因此值得展示 lambda 如何改變形狀。然後，我使用“保存公式”來保存樣條值 - 然後將它們作為目標複製到資料庫中。
你好@約瑟夫_里斯，感謝您的評論，很高興您喜歡這個例子。
- 我很樂意將其作為更廣泛社區的博客文章 - 可能作為 FDE 的短片
- 我假設當您的客戶提到減少雜質時，他們指的是在色譜圖中將它們與感興趣的峰分離。 在這種情況下，我建議他們分兩步進行：
A) 按計劃運行 DOE（或其他實驗批次數據），並通過實際數據集確定最佳設置（這可以由 DOE 分析器告知）
獲取該目標配置文件並根據他們的要求進行調整。 我在原始文章中附上了一個示例，說明如何將目標曲線放在一起- 在這個示例中，我從運行中獲取了一條“良好”曲線並對其進行了調整，以確保峰值之間有明顯的間隙（零兩側的強度）並調整峰尖處的寬度。 您可以使用圖形生成器中的樣條工具創建平滑公式，然後將其帶回到原始數據表中作為目標（如果更改 Lambda，您可以獲得所需的擬合值）。
- 對於目標曲線，目前確實需要手動操作 - 我上面描述的方法效果很好，但依賴於操作當前數據。 如果能添加一個插件來繪製你想要的圖表，那就太棒了。 我對客戶說的是，目標並不總是完美的 - 在這種情況下，我可以只使用兩個相鄰的粗糙“三角形”來代表峰值 - 模型仍然會盡力做到最好來優化設置。
- 從我測試的不同數據集中，FDOE 診斷圖中看到的曲線類型相當正常 - 很多時候，最糟糕的罪魁禍首是位於設計邊緣的設置。 在此示例中，紅色值位於我的設計的邊緣，並且不包含在“均勻”設計空間內。 更多的重複也將有助於改善這一點。
你好@Bingh94 ，謝謝您這篇精彩的帖子！ 這對我來說非常及時，因為我剛剛被問到如何使用 FDE 來最大限度地減少 HPLC 分析中的雜質。 我在閱讀本文時遇到了一些問題和評論，希望得到任何反饋！
- 這可以是自己的博客文章或短視頻演示嗎？ 這聽起來像是已經適合外部受眾的內容，並且 FDE 示例越多越好！
- 在我客戶的例子中，如果您專注於減少雜質，目標曲線是否是最好的方法？ 或者最好使用 FDOE 分析器和合意性設置來最小化某些峰值？
- 關於目標曲線的主題，我們的客戶是否有一種簡單的方法來創建目標曲線，或者大多數人是否通過嘗試輸入適合其預期配置文件的數據集來手動執行此操作？考慮一下加載項如何幫助創建基於在圖表上繪製的數據集或以某種方式修改現有曲線（類似於我們與意願曲線交互的方式）？
- 最後一個問題...在您的示例中，FDOE 診斷圖顯示了一些不尋常的模式。 我們應該對此有多關心，解決這個問題是否需要安裝額外的 GenReg 模型，或者這是否表明我們需要更多數據？
再次感謝您在這裡所做的出色工作！
謝謝本！這是 JMP Pro DEMO 的重要來源！看到這篇文章真的很興奮！
