Un bioensayo es un método analítico para determinar la concentración o potencia de una sustancia por su efecto sobre células o tejidos vivos. Los bioensayos se utilizan para estimar la potencia de los agentes mediante la observación de sus efectos en animales vivos (in vivo) o tejidos (in vitro).
El análisis de ensayos y ensayos biológicos se lleva a cabo comúnmente en las industrias farmacéutica y biotecnológica. Es un componente importante para las presentaciones reglamentarias, el desarrollo de procedimientos operativos estándar y el mantenimiento de buenas prácticas de fabricación.
En las pruebas de bioensayo se utilizan diferentes metodologías. En este blog, describo ejemplos de bioensayos que usan JMP que se usan comúnmente.
La prueba de paralelismo
La prueba de paralelismo proporciona un análisis para probar si los modelos ajustados entre grupos tienen la misma forma pero están desplazados a lo largo del eje X. De acuerdo con los estándares de la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP), es necesario lograr el paralelismo entre un par de funciones de dosis-respuesta antes de validar un bioensayo de potencia. La prueba de paralelismo se encuentra en la plataforma Fit Curve para Curvas Sigmoideas. En este ejemplo, se utilizó una versión modificada del conjunto de datos de bioensayo de la biblioteca de muestras de datos de JMP. Se ajustó un modelo logístico de 4 Parámetros a las tres formulaciones diferentes. Esas tres curvas fueron analizadas y probadas para el paralelismo (Figura 1). Observe que el desplazamiento horizontal es el mismo en todas las dosis. Dos curvas que solo se diferencian por un desplazamiento horizontal se dice que son paralelas. Si el elemento de prueba no tuviera el mismo componente biológicamente activo que el estándar, la potencia relativa variaría en el rango de dosis. En este ejemplo, todas las curvas tienen la misma forma pero se desplazan horizontalmente, y un valor P alto valida nuestros hallazgos, concluyendo que las curvas de las tres curvas de formulación son paralelas.
Figura 1: Prueba de paralelismo (Observe que el cambio horizontal Log (Potencia relativa) ∆ es el mismo en todas las dosis)
La potencia relativa
¿Cómo se estima la Potencia Relativa a partir de EC50 (EC50 es la dosis requerida para que un individuo experimente el 50% del efecto máximo (Figura 2))? Las estimaciones de potencia relativa generalmente se calculan como una relación simple: la EC50 de un estándar bien caracterizado dividida por la EC50 de una muestra. Tales estimaciones son válidas solo cuando las curvas de dosis-respuesta para la muestra y el estándar son paralelas y muestran la misma respuesta máxima alcanzable (eficacia).
Figura 2: Representaciones y cálculos de EC50 para 3 formulaciones
La potencia relativa en JMP se encuentra debajo de la prueba de paralelismo. En la figura 2 se comparan tres formulaciones diferentes: Test A, Test B y New Test.
Al comparar la Nueva Prueba con la Prueba A, la potencia relativa de la Nueva Prueba es menor que uno. Esto indica que sus potencias son diferentes, y la Prueba Nueva es menos potente que la Prueba A, como podemos ver en el gráfico. La potencia relativa para la Prueba B es mayor que para la Prueba A. Esto significa que la formulación del fármaco B aumenta en toxicidad en función de la concentración más rápido que la Prueba A. Si las Potencias relativas son casi uno, esto indica que sus potencias son similares.
La prueba de equivalencia
Figura 3: Modelo logístico 4P que se ajusta a cuatro formulaciones (cuatro parámetros: tasa de crecimiento, punto de inflexión, asíntota inferior y superior)
En la plataforma Ajustar curva, la opción Prueba de equivalencia brinda un análisis para probar la equivalencia de los modelos en los niveles de la variable de agrupación. Los datos del bioensayo se utilizan para este ejemplo (Figura 3). Se comparan cuatro formulaciones diferentes y se prueba si son equivalentes. Un Logistic 4P muestra un ajuste para cuatro parámetros (tasa de crecimiento, punto de inflexión, asíntota inferior y superior). Esos cuatro parámetros se prueban si son equivalentes o no. Tenga en cuenta que la prueba B en azul es diferente a las otras tres formulaciones
Después de seleccionar la opción para Prueba de equivalencia, especifique el nivel de la variable de agrupación que desea probar contra todos los demás niveles (la formulación estándar se usa como variable de agrupación o referencia). Se muestra un informe para cada nivel frente al nivel elegido. La Figura 4 muestra un ejemplo de dos comparaciones (Prueba A versus Estándar y Prueba B versus Estándar).
Figura 4: Prueba de equivalencia para la prueba A versus el estándar y la prueba B versus el estándar.
La igualdad de los parámetros se prueba analizando la relación de los parámetros. Las líneas de decisión predeterminadas se colocan en valores de relación de 0,8 y 1,25, lo que representa una diferencia del 25 %.
Si todos los intervalos de confianza están dentro de las líneas de decisión, entonces los dos grupos son prácticamente iguales. Si un solo intervalo queda fuera de las líneas, entonces no podemos concluir que los grupos son iguales. En nuestro ejemplo, la Prueba B no es equivalente al Estándar, ya que el punto de inflexión para la formulación del fármaco B es más bajo que el estándar, lo que concuerda con la Figura 3 .
La predicción inversa y EC50
Quizá le interese saber a qué Dosis o Concentración del fármaco alcanza un valor de Toxicidad específico. Esto es para predecir los valores X para un valor Y específico o lo que hace la predicción inversa.
Este es un paso importante, por ejemplo, para calcular EC50/IC50. La EC50 es la concentración de un fármaco que es necesaria para provocar la mitad de la máxima. En un experimento de unión, la IC50 es la concentración de un ligando o inhibidor en la que la mitad del objetivo está presente en la etapa unida. Se usa comúnmente como una medida de la potencia de un fármaco (ver arriba), aunque se prefiere el uso de EC50 al de "potencia", que ha sido criticado por su vaguedad ( árbitro ).
A partir de la curva ajustada, utilice en el triángulo rojo del modelo la opción predicción inversa personalizada, especifique la Y (la respuesta como toxicidad) para predecir la X (como la concentración logarítmica o la dosis). Se muestra un gráfico y el valor pronosticado de la X con intervalos de confianza del 95 % (Figura 5).
Figura 5: Estimación de predicción inversa
La estimación de Vmax y Km de Michaelis-Menten Kinetics
En bioquímica, la cinética de Michaelis-Menten es uno de los modelos más conocidos de cinética enzimática. Lleva el nombre de la bioquímica alemana Leonor Michaelis y la médica canadiense Maud Menten. El modelo toma la forma de una ecuación que describe la velocidad de las reacciones enzimáticas ( v ), su fórmula y la curva se muestra en la Figura 6.
Figura 6: Ecuación de Michaelis Menten y ajuste del modelo.
El parámetro a representa la velocidad de reacción máxima (en la literatura a menudo denominada V máximo ), y el b parámetro (en la literatura a menudo referido como la Constante de Michaelis o K metro ) es el valor de x tal que la respuesta es la mitad de V máximo . Es una medida inversa de la afinidad del sustrato por la enzima. k metro es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato. Los sustratos que se unen fuertemente tienen K pequeño metro valores; los sustratos que se unen débilmente tienen valores de Km grandes.
Usando la plataforma Fit curve y eligiendo el modelo Michaelis-Menten, es fácil extraer tanto V máximo y k metro de la ecuación. Vea el ejemplo en la Figura 7.
Figura 7: Estimación del parámetro a (Vmax) y del parámetro b (Km) en el ajuste de la curva de Michaelis-Menten.
