Ein Bioassay ist eine Analysemethode zur Bestimmung der Konzentration oder Potenz einer Substanz durch ihre Wirkung auf lebende Zellen oder Gewebe. Bioassays werden verwendet, um die Wirksamkeit von Wirkstoffen abzuschätzen, indem ihre Auswirkungen auf lebende Tiere (in vivo) oder Gewebe (in vitro) beobachtet werden.
Die Analyse biologischer Assays und Tests wird üblicherweise in der pharmazeutischen und biotechnologischen Industrie durchgeführt. Es ist eine wichtige Komponente für behördliche Einreichungen, die Entwicklung von Standardarbeitsanweisungen und die Aufrechterhaltung guter Herstellungspraktiken.
Bei Bioassay-Tests werden verschiedene Methoden verwendet. In diesem Blog beschreibe ich Bioassay-Beispiele mit JMP, die häufig verwendet werden.
Der Parallelitätstest
Der Parallelitätstest bietet eine Analyse zum Testen, ob die angepassten Modelle zwischen Gruppen die gleiche Form haben, aber entlang der X-Achse verschoben sind. Gemäß den Standards der United States Pharmacopeial Convention (USP) muss vor der Validierung eines Potenz-Bioassays eine Parallelität zwischen zwei Dosis-Reaktionsfunktionen erreicht werden. Der Parallelitätstest befindet sich in der Fit Curve-Plattform für Sigmoidkurven. In diesem Beispiel wurde eine modifizierte Version des Bioassay-Datensatzes aus der JMP-Datenprobenbibliothek verwendet. Ein logistisches 4-Parameter-Modell wurde an die drei verschiedenen Formulierungen angepasst. Diese drei Kurven wurden analysiert und auf Parallelität getestet (Abbildung 1). Beachten Sie, dass die horizontale Verschiebung bei allen Dosen gleich ist. Zwei Kurven, die sich nur durch eine horizontale Verschiebung unterscheiden, heißen parallel. Wenn der Testgegenstand nicht dieselbe biologisch aktive Komponente wie der Standard hätte, würde die relative Potenz über den Dosisbereich variieren. In diesem Beispiel haben alle Kurven die gleiche Form, sind aber horizontal verschoben, und ein hoher P-Wert bestätigt unsere Ergebnisse und schließt daraus, dass die Kurven der drei Formulierungskurven parallel sind.
Abbildung 1: Parallelitätstest (Beachten Sie, dass sich der Log (relative Potenz) horizontal verschiebt ∆ ist bei allen Dosierungen gleich)
Die relative Potenz
Wie wird die relative Potenz aus EC50 geschätzt (EC50 ist die Dosis, die erforderlich ist, damit eine Person 50 % der maximalen Wirkung erfährt (Abbildung 2)). Schätzungen der relativen Potenz werden im Allgemeinen als einfaches Verhältnis berechnet: der EC50 eines gut charakterisierten Standards dividiert durch den EC50 einer Probe. Solche Schätzungen sind nur gültig, wenn die Dosis-Wirkungs-Kurven für die Probe und den Standard parallel verlaufen und dieselbe maximal erreichbare Wirkung (Wirksamkeit) aufweisen.
Abbildung 2: EC50-Darstellungen und Berechnungen für 3 Formulierungen
Die relative Potenz in JMP befindet sich unterhalb des Parallelitätstests. In Abbildung 2 werden drei verschiedene Formulierungen verglichen: Test A, Test B und Neuer Test.
Beim Vergleich des Neuen Tests mit Test A ist die relative Potenz für den Neuen Test kleiner als eins. Dies weist darauf hin, dass ihre Potenzen unterschiedlich sind und der neue Test weniger stark ist als Test A, wie wir in der Grafik sehen können. Die relative Potenz für Test B ist größer als für Test A. Dies bedeutet, dass die Toxizität der Arzneimittelformulierung B als Funktion der Konzentration schneller zunimmt als bei Test A. Wenn die relativen Potenzen fast eins sind, zeigt dies an, dass ihre Potenzen ähnlich sind.
Der Äquivalenztest
Abbildung 3: Logistisches 4P-Modell, das vier Formulierungen anpasst (vier Parameter: Wachstumsrate, Wendepunkt, untere und obere Asymptote)
In der Fit Curve-Plattform bietet die Option Äquivalenztest eine Analyse zum Testen der Äquivalenz von Modellen über Ebenen der Gruppierungsvariablen hinweg. Für dieses Beispiel werden die Bioassay-Daten verwendet (Abbildung 3). Vier verschiedene Formulierungen werden verglichen und auf Äquivalenz getestet. Ein Logistic 4P zeigt eine Anpassung für vier Parameter (Wachstumsrate, Wendepunkt, untere und obere Asymptote). Diese vier Parameter werden daraufhin getestet, ob sie äquivalent sind oder nicht. Beachten Sie, dass sich Test B in Blau von allen drei anderen Formulierungen unterscheidet
Nachdem Sie die Option für den Äquivalenztest ausgewählt haben, geben Sie die Ebene der Gruppierungsvariablen an, die Sie gegen jede andere Ebene testen möchten (Standardformulierung wird als Gruppierungsvariable oder Referenz verwendet). Ein Bericht wird für jede Ebene im Vergleich zur ausgewählten Ebene angezeigt. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für zwei Vergleiche (Test A versus Standard und Test B versus Standard).
Abbildung 4: Äquivalenztest für Test A gegenüber dem Standard und Test B gegenüber dem Standard.
Die Gleichheit der Parameter wird getestet, indem das Verhältnis der Parameter analysiert wird. Die Standardentscheidungslinien werden bei Verhältniswerten von 0,8 und 1,25 platziert, was einer Differenz von 25 % entspricht.
Wenn alle Konfidenzintervalle innerhalb der Entscheidungslinien liegen, sind die beiden Gruppen praktisch gleich. Wenn ein einzelnes Intervall außerhalb der Linien liegt, können wir nicht schlussfolgern, dass die Gruppen gleich sind. In unserem Beispiel entspricht Test B nicht dem Standard, da der Wendepunkt für Arzneimittelformulierung B niedriger als der Standard ist, was mit Abbildung 3 übereinstimmt .
Die inverse Vorhersage und EC50
Es könnte Sie interessieren, bei welcher Dosis oder Konzentration des Arzneimittels ein bestimmter Toxizitätswert erreicht wird. Dies dient dazu, die X-Werte für einen bestimmten Y-Wert vorherzusagen oder was die inverse Vorhersage tut.
Dies ist beispielsweise ein wichtiger Schritt zur Berechnung von EC50/IC50. Der EC50 ist die Konzentration eines Medikaments, die notwendig ist, um die Hälfte des Maximums zu bewirken. In einem Bindungsexperiment ist die IC50 die Konzentration eines Liganden oder Inhibitors, bei der die Hälfte des Ziels im gebundenen Stadium vorhanden ist. Es wird allgemein als Maß für die Potenz eines Medikaments verwendet (siehe oben), obwohl die Verwendung von EC50 der „Potenz“ vorgezogen wird, die wegen ihrer Unbestimmtheit kritisiert wurde ( Ref ).
Verwenden Sie aus der angepassten Kurve im roten Dreieck des Modells die Option benutzerdefinierte inverse Vorhersage, geben Sie das Y (die Reaktion wie Toxizität) an, um das X (wie die logarithmische Konzentration oder Dosis) vorherzusagen. Ein Diagramm und der vorhergesagte Wert von X mit 95 %-Konfidenzintervallen werden angezeigt (Abbildung 5).
Abbildung 5: Inverse Vorhersageschätzung
Die Vmax- und Km-Schätzung von Michaelis-Menten Kinetics
In der Biochemie ist die Michaelis-Menten-Kinetik eines der bekanntesten Modelle der Enzymkinetik. Es ist nach der deutschen Biochemikerin Leonor Michaelis und der kanadischen Ärztin Maud Menten benannt. Das Modell hat die Form einer Gleichung, die die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen beschreibt ( v ), seine Formel und die Kurve sind in Abbildung 6 dargestellt.
Abbildung 6: Michaelis-Menten-Gleichung und Modellanpassung.
Der Parameter a stellt die maximale Reaktionsgeschwindigkeit dar (in der Literatur oft als V bezeichnet max ), und die b Parameter (in der Literatur oft als Michaelis-Konstante oder K bezeichnet m ) ist der Wert von x, sodass die Antwort die Hälfte von V ist max . Sie ist ein inverses Maß der Affinität des Substrats für das Enzym. K m ist ein Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat. Substrate, die fest binden, haben ein kleines K m Werte; schwach bindende Substrate haben große Km-Werte.
Mit der Fit-Curve-Plattform und der Wahl des Michaelis-Menten-Modells lassen sich sowohl V max und k m aus der Gleichung. Siehe das Beispiel in Abbildung 7.
Abbildung 7: Schätzung von Parameter a (Vmax) und Parameter b (Km) in Michaelis-Menten-Kurvenanpassung.
