Un saggio biologico è un metodo analitico per determinare la concentrazione o la potenza di una sostanza in base al suo effetto su cellule o tessuti viventi. I biodosaggi vengono utilizzati per stimare la potenza degli agenti osservando i loro effetti sugli animali viventi (in vivo) o sui tessuti (in vitro).
L'analisi di analisi e test biologici viene comunemente eseguita nelle industrie farmaceutiche e biotecnologiche. È una componente importante per le presentazioni normative, lo sviluppo di procedure operative standard e il mantenimento di buone pratiche di fabbricazione.
Diverse metodologie sono utilizzate nei test di biodosaggio. In questo blog descrivo esempi di saggi biologici che utilizzano JMP che sono comunemente usati.
Il test di parallelismo
Il test di parallelismo fornisce un'analisi per verificare se i modelli adattati tra i gruppi hanno la stessa forma ma sono spostati lungo l'asse X. Secondo gli standard della Convenzione Farmacopea degli Stati Uniti (USP), il parallelismo tra una coppia di funzioni dosi-risposte deve essere raggiunto prima di convalidare un test biologico di potenza. Il test di parallelismo si trova nella piattaforma Fit Curve per le curve sigmoidee. In questo esempio è stata utilizzata una versione modificata del set di dati Bioassay dalla libreria di campioni di dati JMP. Un modello logistico a 4 parametri è stato adattato alle tre diverse formulazioni. Queste tre curve sono state analizzate e testate per il parallelismo (Figura 1). Si noti che lo spostamento orizzontale è lo stesso a tutte le dosi. Due curve che differiscono solo per uno spostamento orizzontale si dicono parallele. Se l'elemento in esame non avesse lo stesso componente biologicamente attivo dello standard, la potenza relativa varierebbe nell'intervallo di dose. In questo esempio, tutte le curve hanno la stessa forma ma sono spostate orizzontalmente e un valore P elevato convalida i nostri risultati, concludendo che le curve delle tre curve di formulazione sono parallele.
Figura 1: test di parallelismo (si noti che lo spostamento orizzontale del registro (potenza relativa). ∆ è lo stesso a tutte le dosi)
La potenza relativa
Come viene stimata la potenza relativa da EC50 (EC50 è la dose necessaria affinché un individuo sperimenti il 50% dell'effetto massimo (Figura 2)). Le stime della potenza relativa sono generalmente calcolate come un semplice rapporto: l'EC50 di uno standard ben caratterizzato diviso l'EC50 di un campione. Tali stime sono valide solo quando le curve dose-risposta per il campione e lo standard sono parallele e mostrano la stessa risposta massima ottenibile (efficacia).
Figura 2: Rappresentazioni e calcoli EC50 per 3 formulazioni
La potenza relativa in JMP si trova sotto il test del parallelismo. Nella figura 2 vengono messe a confronto tre diverse formulazioni: Test A, Test B e New Test.
Quando si confronta il nuovo test con il test A, la potenza relativa per il nuovo test è inferiore a uno. Ciò indica che le loro potenze sono diverse e il New Test è meno potente del Test A, come possiamo vedere nel grafico. La potenza relativa per il test B è maggiore che per il test A. Ciò significa che la formulazione del farmaco B aumenta in tossicità in funzione della concentrazione più velocemente rispetto al test A. Se le potenze relative sono quasi una, ciò indica che le loro potenze sono simili.
Il test di equivalenza
Figura 3: modello logistico 4P che corrisponde a quattro formulazioni (quattro parametri: tasso di crescita, punto di flesso, asintoto inferiore e superiore)
Nella piattaforma Stima curva, l'opzione Test di equivalenza fornisce un'analisi per testare l'equivalenza dei modelli tra i livelli della variabile di raggruppamento. I dati del Bioassay vengono utilizzati per questo esempio (Figura 3). Quattro diverse formulazioni vengono confrontate e verificate se sono equivalenti. Un Logistic 4P mostra un adattamento per quattro parametri (tasso di crescita, punto di flesso, asintoto inferiore e superiore). Questi quattro parametri vengono verificati se sono equivalenti o meno. Si noti che il test B in blu è diverso da tutte e tre le altre formulazioni
Dopo aver selezionato l'opzione Test di equivalenza, specificare il livello della variabile di raggruppamento che si desidera verificare rispetto a ogni altro livello (la formulazione standard viene utilizzata come variabile di raggruppamento o riferimento). Viene visualizzato un report per ogni livello rispetto al livello scelto. La Figura 4 mostra un esempio di due confronti (Test A rispetto a Standard e Test B rispetto a Standard).
Figura 4: Test di equivalenza per il test A rispetto allo standard e il test B rispetto allo standard.
L'uguaglianza dei parametri viene testata analizzando il rapporto dei parametri. Le linee di decisione predefinite sono posizionate a valori di rapporto di 0,8 e 1,25, che rappresentano una differenza del 25%.
Se tutti gli intervalli di confidenza sono all'interno delle linee decisionali, allora i due gruppi sono praticamente uguali. Se un singolo intervallo cade al di fuori delle righe, non possiamo concludere che i gruppi sono uguali. Nel nostro esempio, il test B non è equivalente allo standard, poiché il punto di flesso per la formulazione del farmaco B è inferiore allo standard, il che concorda con la Figura 3 .
La previsione inversa e EC50
Potresti essere interessato a sapere a quale dose o concentrazione del farmaco raggiunge uno specifico valore di tossicità. Questo serve per prevedere i valori X per un valore Y specifico o cosa fa la previsione inversa.
Questo è un passaggio importante, ad esempio per calcolare EC50/IC50. L'EC50 è la concentrazione di un farmaco necessaria per causare la metà del massimo. In un esperimento di legame, l'IC50 è la concentrazione di un ligando o inibitore alla quale metà del bersaglio è presente allo stadio legato. È comunemente usato come misura della potenza di un farmaco (vedi sopra), sebbene l'uso di EC50 sia preferito a quello di "potenza", che è stato criticato per la sua vaghezza ( rif ).
Dalla curva adattata, utilizzare nel triangolo rosso del modello l'opzione previsione inversa personalizzata, specificare la Y (la risposta come la tossicità) per prevedere la X (come la concentrazione logaritmica o la dose). Vengono visualizzati un grafico e il valore previsto della X con intervalli di confidenza del 95% (Figura 5).
Figura 5: stima della previsione inversa
La stima di Vmax e Km dalla cinetica di Michaelis-Menten
In biochimica, la cinetica di Michaelis-Menten è uno dei modelli più noti di cinetica enzimatica. Prende il nome dal biochimico tedesco Leonor Michaelis e dal medico canadese Maud Menten. Il modello assume la forma di un'equazione che descrive la velocità delle reazioni enzimatiche ( v ), la sua formula e la curva sono mostrate in Figura 6.
Figura 6: Equazione di Michaelis Menten e adattamento del modello.
Il parametro un rappresenta la massima velocità di reazione (in letteratura spesso indicata come V max ), e il b parametro (in letteratura spesso indicato come Michaelis Constant o K m ) è il valore di x tale che la risposta è metà V max . È una misura inversa dell'affinità del substrato per l'enzima. K m è una misura dell'affinità dell'enzima per il substrato. I substrati che si legano strettamente hanno piccoli K m i valori; i substrati che si legano debolmente hanno valori Km elevati.
Utilizzando la piattaforma Fit curve e scegliendo il modello di Michaelis-Menten, è facile estrarre sia V max e k m dall'equazione. Vedere l'esempio in Figura 7.
Figura 7: Stima del parametro a (Vmax) e del parametro b (Km) nell'adattamento della curva di Michaelis-Menten.
