La colonna QbD: QbD è applicabile per lo sviluppo di metodi analitici?Nota dell'editore: Questo post è di @ronkenett E @david_s del Gruppo KPA . Fa parte di una serie di post sul blog chiamati La colonna QbD . Per ulteriori informazioni sugli autori, fare clic sui nomi delle comunità degli autori sopra.
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Lo sviluppo di metodi di misurazione o analitici va di pari passo con lo sviluppo di prodotti farmaceutici. La comprensione dei requisiti di monitoraggio e controllo del processo guida i criteri di prestazione per i metodi analitici, inclusi gli attributi critici di qualità del processo (CQA) e i limiti delle specifiche. Scoprire le caratteristiche di una sostanza farmaceutica che richiedono controllo per garantirne la sicurezza o l'efficacia determina l'identificazione dei CQA. I requisiti tipici dei metodi analitici includono:
- Precisione: Questo requisito garantisce che la variabilità del metodo sia solo una piccola percentuale dell'intervallo delle specifiche (limite superiore delle specifiche – limite inferiore delle specifiche). Questo è anche chiamato riproducibilità e ripetibilità del misuratore (GR&R).
- Selettività: Ciò determina quali impurità monitorare in ciascuna fase di produzione e specifica metodi di progettazione che discriminano adeguatamente le proporzioni relative di ciascuna impurità.
- Sensibilità: Per ottenere un controllo efficace del processo, ciò richiede metodi che riflettano accuratamente i cambiamenti importanti nei CQA rispetto ai limiti delle specifiche.
Questi criteri stabiliscono l'affidabilità dei metodi da utilizzare nelle operazioni di routine. Ciò ha implicazioni sul tempo di analisi, sui solventi accettabili e sulle attrezzature disponibili. Per sviluppare un metodo analitico con i principi QbD, è necessario comprendere i criteri di prestazione del metodo, nonché l'intento operativo desiderato dall'eventuale utente finale. La comprensione limitata di un metodo può portare a uno scarso trasferimento di tecnologia dal laboratorio all'uso in impianti di produzione commerciale o da una struttura esistente a una nuova. I trasferimenti falliti spesso richiedono notevoli risorse aggiuntive per porre rimedio alle cause del fallimento, di solito in un momento in cui vi è una notevole pressione per procedere con il lancio di un nuovo prodotto. L’applicazione del Quality by Design (QbD) ai metodi analitici mira a prevenire tali problemi. L'implementazione del QbD nello sviluppo di metodi analitici è tipicamente un processo in quattro fasi, che affronta sia la progettazione che il controllo dei metodi [1] . Le fasi sono:
- Intento di progettazione del metodo : Identificare e specificare le prestazioni del metodo analitico.
- Selezione del progetto del metodo : selezionare le condizioni di lavoro del metodo per raggiungere l'intento progettuale.
- Definizione del controllo del metodo : Stabilire e definire controlli appropriati per i componenti che contribuiscono maggiormente alla variabilità delle prestazioni.
- Convalida del controllo del metodo : Dimostrare prestazioni accettabili del metodo con controlli robusti ed efficaci.
Testare la robustezza dei metodi analitici implica valutare l'influenza di piccoli cambiamenti nelle condizioni operative [2] . Il test di robustezza identifica il grado di riproducibilità dei risultati dei test ottenuti dall'analisi dello stesso campione in varie condizioni di test normali come diversi laboratori, analisti e strumenti. Nel seguente caso di studio, ci concentreremo sull'uso di esperimenti per valutare e migliorare la robustezza.
Un caso di studio nello sviluppo di HPLC
Il caso di studio qui presentato riguarda lo sviluppo di un metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). [3] . È un tipico esempio di verifica della robustezza dei metodi analitici. Il sistema specifico è costituito da un Agilent 1050, con un rilevatore UV a lunghezza d'onda variabile e un integratore modello 3396-A. L'obiettivo dello studio di robustezza è scoprire se le deviazioni dalle condizioni operative nominali influenzano i risultati. La tabella 1 elenca i fattori e i relativi livelli utilizzati in questo caso di studio. L'array sperimentale è un 2 7-4 Esperimento fattoriale frazionario con tre punti centrali (vedi Tabella 2). I livelli "-1" e "1" corrispondono ai livelli inferiore e superiore elencati nella Tabella 1 e "0" corrisponde al livello nominale. I livelli inferiore e superiore vengono scelti per riflettere la variazione che potrebbe naturalmente verificarsi sull'impostazione nominale durante il normale funzionamento. Per esempi di applicazioni QbD di esperimenti fattoriali frazionari alla formulazione e allo sviluppo di prodotti farmaceutici, consultare il secondo E terzo post del blog in questa serie.
Tabella 1. Fattori e livelli nell'esperimento HPLC.
Tavolo 2. Array sperimentale dell'esperimento HPLC.
La matrice sperimentale è composta da 11 esecuzioni sperimentali che combinano i livelli dei fattori di progettazione in un insieme equilibrato di combinazioni e tre punti centrali.
Cosa possiamo imparare dagli esperimenti HPLC
Analizzando l'esperimento HPLC, abbiamo i seguenti obiettivi:
- Trovare la varianza prevista della previsione di misurazione del metodo per le configurazioni consigliate del metodo (l'incertezza di misurazione).
- Identificare le migliori impostazioni dei fattori sperimentali per ottenere prestazioni accettabili.
- Determinare i fattori che influiscono sulle prestazioni del metodo su una o più risposte.
- Valutare l'impatto della variabilità dei fattori sperimentali sulle risposte misurate.
- Rendere robusto il processo HPLC sfruttando la non linearità negli effetti dei fattori per ottenere prestazioni che non siano sensibili ai cambiamenti rispetto ai livelli nominali.
Se consideriamo solo le otto esecuzioni sperimentali del 2 7-4 fattoriale frazionario, senza i punti centrali, otteniamo una varianza media di previsione di 0,417 e un'ottimalità del 100% per l'adattamento di un modello del primo ordine. Ciò è dovuto alla proprietà equilibrata del progetto (vedere Figura 1 a sinistra). Il disegno nella Tabella 2, con tre punti centrali, riduce l'incertezza della previsione vicino al centro della regione e presenta una varianza di previsione media inferiore pari a 0,38. Tuttavia, i punti centrali non contribuiscono alla stima delle pendenze, come si vede nella minore efficienza per l'adattamento del modello del primo ordine (vedere Figura 1 a destra). 
Figura 1. Progettare la diagnostica per questo fattoriale frazionario senza (a sinistra) e con (a destra) tre punti centrali.
Figura 2. Profilo della varianza della previsione senza (in alto) e con (in basso) punti centrali.
Il profilo della varianza della previsione JMP nella Figura 2 mostra il rapporto tra la varianza della previsione e la varianza dell'errore, chiamata anche varianza relativa della previsione, a varie combinazioni a livello di fattore. La varianza relativa è ridotta al minimo al centro del progetto. L'aggiunta di tre punti centrali riduce la varianza della previsione del 25%, da 0,12 a 0,09. Questo è un vantaggio derivato dall'aggiunta di corse sperimentali nei punti centrali. Un altro vantaggio che vedremo più avanti è che i punti centrali ci permettono di valutare gli effetti non lineari o la mancanza di adattamento al modello di regressione lineare. Un terzo vantaggio è che i punti centrali ci forniscono una stima senza modello dell’entità della variazione naturale nel sistema. Per ciascuna combinazione di livello di fattore, gli esperimenti hanno prodotto cinque risposte: 1) Area del cromatogramma al picco (peakArea), 2) Altezza del cromatogramma al picco (peakHeight), 3) Tempo di ritenzione minimo adattato allo standard (tRmin), 4) Minimo non aggiustato tempo di ritenzione (unad tRmin) e 5) Risoluzione del cromatogramma (Res). La nostra prima preoccupazione nell’analizzare i dati è identificare modelli adeguati che colleghino fattori e risposte.
Cosa impariamo analizzando i dati dell’esperimento fattoriale frazionario?
I modelli di regressione lineare sono i modelli più semplici da considerare. Rappresentano i cambiamenti nelle risposte tra due livelli di fattori, nel nostro caso ciò corrisponde ai livelli etichettati “-1” e “+1”. Poiché abbiamo anche tre punti centrali, ai livelli etichettati “0”, possiamo anche valutare effetti non lineari. Lo facciamo, come nel nostro secondo post sul blog, aggiungendo una variabile indicatore sintetica progettata per valutare la mancanza di adattamento (LOF) che è uguale a “1” nei punti centrali e “0” altrove. Il rapporto di riepilogo degli effetti JMP, per tutte e cinque le risposte con effetti lineari su tutti e sette i fattori e l'indicatore LOF, è presentato nella Figura 3. 
Figura 3. Effetto Rapporto riassuntivo di sette fattori e indicatore LOF su cinque risposte.
La tabella Riepilogo degli effetti elenca gli effetti del modello nell'intera serie di cinque risposte, ordinati per valori p ascendenti. Il LogWorth per ciascun effetto è definito come -log10(p-value), che regola i valori p per fornire una scala appropriata per la grafica. Un LogWorth che supera 2 è significativo al livello 0,01 perché -log10(0,01)=2. Il rapporto include un grafico a barre del LogWorth con linee verticali tratteggiate in corrispondenza dei valori interi e una linea di riferimento blu in corrispondenza di 2. I valori p visualizzati corrispondono al test di significatività visualizzato nella tabella Test degli effetti del report del modello. Il rapporto nella Figura 3 mostra che, nel complesso, quattro fattori e LOF sono significativi al livello 0,01 (Col Temp, Gradient, Buf PH e Dim Perc) e Buf Conc, Det Wave e Trie Perc non sono significativi. Dal piano sperimentale in Tabella 2, è possibile stimare gli effetti principali dei sette fattori e dell'indicatore LOF sulle cinque risposte con un modello lineare. La Figura 4 presenta le stime dei parametri per peakHeight con un R corretto 2 del 93%, un ottimo adattamento. La risposta peakHeight è più sensibile alle variazioni di Col Temp, Det Wave e Gradient.
Figura 4. Stime dei parametri di peakHeight di sette fattori e indicatore LOF con modello lineare. Per una migliore leggibilità, i picchi sono stati divisi per 1000.
Osserviamo una differenza statisticamente significativa tra il valore previsto nel punto centrale del disegno sperimentale e le tre misurazioni effettivamente eseguite lì (tramite la variabile LOF). La Figura 5 mostra un grafico del profiler che mostra gli effetti lineari di ciascun fattore su tutte e cinque le risposte.Il grafico è molto utile per evidenziare quali condizioni potrebbero influenzare il metodo HPLC. Vediamo che Col Temp e Gradient, i due fattori più importanti, influenzano diverse risposte.Buf pH, Buf Conc e Dim Perc hanno effetti particolarmente forti sulle risposte di ritenzione, ma hanno effetti deboli sugli altri CQA.I fattori si adattano bene alle risposte di ritenzione e a peakHeight, ma non a peakArea o Res, il che si riflette nelle ampie bande di confidenza per tali CQA e negli elevati valori p per i test F del modello complessivo nella riga Analisi della varianza dell'output del modello.
Figura 5. Profiler di esperimenti HPLC con modello lineare.
Cosa dovremmo fare riguardo alla non linearità? La nostra analisi ha rilevato un effetto significativo dell'indicatore LOF, che indica un effetto non lineare che non viene preso in considerazione nel profiler della Figura 5. I punti centrali che abbiamo aggiunto al disegno fattoriale frazionario a due livelli ci consentono di rilevare la non linearità, ma non forniscono informazioni sufficienti per determinare cosa la causa: ciascuno dei sette fattori (e forse diversi di essi) potrebbe essere responsabile di l'effetto non lineare sull'altezza del picco.Nel nostro prossimo blog discuteremo alcune opzioni di progettazione per risolvere il problema. Per ora mostriamo cosa abbiamo ottenuto con l'esperimento attuale. Dopo un lungo brainstorming, il team HPLC ha deciso che era molto probabile che il gradiente fosse il fattore che causava la non linearità. Questo importante presupposto, basato solo sulla conoscenza del processo, è cruciale per tutte le nostre conclusioni successive.Abbiamo proceduto ad adattare un modello ai dati sperimentali originali che include un effetto quadratico per il Gradiente. Il team ha inoltre deciso di conservare solo i fattori con gli effetti principali più forti per ciascuna risposta; per peakHeight, i fattori erano gradiente, temperatura della colonna e lunghezza d'onda di rilevamento. Nella Figura 6 mostriamo le stime dei parametri derivanti dall'adattamento di questo modello ridotto alle risposte peakHeight. Con questo modello, tutti i termini sono significativi con una R corretta 2 dell'89%.L'errore quadratico medio, che stima la variazione da un'analisi all'altra con le stesse impostazioni dei fattori, è 1,754, leggermente inferiore all'1% dell'entità di peakHeight stesso (dopo aver diviso peakHeight per 1.000).
Figura 6. Stime dei parametri di peakHeight con modello quadratico. Per una migliore leggibilità, i picchi sono stati divisi per 1000.
Mostriamo un Profiler per il modello quadratico ridotto nella Figura 7. 
Figura 7. Profiler dell'esperimento HPLC con modello quadratico ridotto per peakHeight. Per una migliore leggibilità, i picchi sono stati divisi per 1000.
Trovare una soluzione solida
Uno degli obiettivi principali dell'esperimento era valutare la robustezza del sistema alla variazione dei fattori di input. Esploriamo questa domanda introducendo il rumore normale nei quattro fattori nel modello quadratico ridotto. Per ciascuno dei tre fattori, abbiamo assunto una deviazione standard di 0,4 (nelle unità codificate), che è l'opzione predefinita in JMP. Ciò riflette la visione secondo cui le impostazioni sperimentali sono circa 2,5 DS rispetto al livello nominale, quindi riflettono deviazioni piuttosto estreme che potrebbero essere riscontrate nella pratica. La Figura 8 presenta l'effetto del rumore su peakHeight per un'impostazione nel punto centrale inizialmente identificato come impostazione nominale.Possiamo calcolare la SD dei risultati simulati salvandoli in una tabella e utilizzando la scheda "distribuzione" in JMP. La DS risulta essere 2.397 ed è leggermente più grande della DS da eseguire a esecuzione che abbiamo calcolato in precedenza di 1.754. La DS complessiva associata al sistema analitico coinvolge entrambe queste componenti. Per combinarli, dobbiamo prima elevarli al quadrato, poi sommarli (perché le varianze sono additivi, non SD) e poi prendere una radice quadrata per tornare alla scala di misurazione originale. La SD combinata risultante è 2,970, quindi la variazione prevista nelle impostazioni dei fattori porta a una SD maggiore di circa il 70% rispetto a quella derivante dalla sola variazione da un'analisi all'altra.La SD complessiva è inferiore all'1,5% dei valori tipici di peakHeight ed è stata considerata accettabile per questo processo.
La nostra soluzione nominale è buona in termini di robustezza?
La Figura 8 è molto utile per rispondere a questa domanda. Il fattore importante qui è il gradiente, attraverso la sua relazione non lineare con peakHeight. La “valle” di quella relazione è vicina alla scelta nominale di 0. La nostra simulazione della variazione del fattore genera valori di gradiente che coprono l'intervallo da -1 a 1. Quando questi valori sono nella valle, trasmettono pochissime variazioni a peakHeight. Al contrario, quando sono vicini agli estremi, c'è una variazione sostanziale nell'altezza del picco. Quindi il fatto che il fondovalle sia vicino all'impostazione nominale ci assicura che la variazione trasmessa sarà la più piccola possibile. Possiamo testare questa funzionalità spostando il valore nominale di Gradiente. Quando il valore nominale è -0,5, il simulatore mostra che la SD derivante dalla variazione del fattore aumenta a 4,282, quasi l'80% in più rispetto all'impostazione nominale pari a 0. La dipendenza di peakHeight da Col Temp e da Det Wave è lineare. Quindi, indipendentemente da come scegliamo le impostazioni nominali di questi fattori, essi trasmetteranno lo stesso grado di variazione all'uscita peakHeight. L'esperimento ci consente di valutare come influenzano la robustezza, ma non fornisce alcuna opportunità di sfruttare i risultati per migliorare la robustezza.
Figura 8. Profilo di previsione di peakHeight quando i fattori sono alle impostazioni nominali e la SD naturale è 0,4. Per una migliore leggibilità, i picchi sono stati divisi per 1000.
Ritornando alle domande iniziali
Riesaminando le domande originariamente poste, possiamo ora fornire le seguenti risposte:
1. Qual è la varianza prevista della previsione di misurazione del metodo per le impostazioni consigliate del metodo (l'incertezza di misurazione).
Risposta: Abbiamo esaminato questa domanda più da vicino per peakHeight, dove abbiamo scoperto che la SD è 2970, con contributi più o meno uguali dalla variazione da un'esecuzione all'altra e dalla variazione dei fattori del processo di misurazione.
2. Quale configurazione dei fattori sperimentali consentirà di ottenere prestazioni accettabili?
Risposta: Con tutti i fattori alle impostazioni nominali (valore codificato a 0), la SD di 2970 è inferiore all'1,5% della dimensione dei valori misurati, che è un livello di variazione accettabile in questa applicazione.
3. Quali sono i fattori che influenzano la performance del metodo in una o più risposte?
Risposta: I tre fattori con il maggiore impatto sulle prestazioni del metodo sono il profilo del gradiente, la temperatura della colonna e l'onda di rilevamento.
4. Possiamo rendere robusta la configurazione dei fattori sperimentali al fine di ottenere prestazioni che non siano sensibili ai cambiamenti nei livelli dei fattori?
Risposta: Abbiamo visto che possiamo migliorare la robustezza di peakHeight impostando il gradiente sul livello codificato pari a 0 (il livello nominale nell'esperimento). Questa impostazione ci aiuta a sfruttare l'effetto non lineare del gradiente e a ridurre la variazione trasmessa.
5. Possiamo valutare l'impatto della variabilità dei fattori sperimentali sul metodo analitico?
Risposta: Come notato in precedenza, la variabilità naturale dei fattori di input è responsabile di poco più della metà della variazione di peakHeight.
Incartare
Nel rivedere le domande originariamente poste, adattiamo innanzitutto un modello di regressione lineare. Dopo aver realizzato che esiste un effetto non lineare non contabilizzato, abbiamo utilizzato un modello quadratico ridotto e abbiamo scoperto che si adatta bene ai dati. Inducendo la variabilità nei fattori della quadratica ridotta (profilo del gradiente, temperatura della colonna e onda di rilevamento), abbiamo potuto stimare la variabilità dovuta al metodo e valutare la robustezza della configurazione raccomandata. Il presupposto del team secondo cui il gradiente è responsabile della non linearità è chiaramente importante in questo caso. Se anche altri fattori avessero effetti non lineari, potrebbero esserci conseguenze su come migliorare al meglio la robustezza del metodo. Esploreremo ulteriormente questo problema nel nostro prossimo post sul blog.
Appunti
[1] Borman, P., Nethercote, P., Chatfield, M., Thompson, D., Truman, K. (2007), Tecnologia farmaceutica. http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[2] Kenett, RS e Kenett, DA (2008), Applicazioni di qualità in base alla progettazione nei prodotti tecnologici biosimilari , Accreditamento e garanzia di qualità, Springer Verlag, vol. 13, n. 12, pp. 681-690.
[3] Romero R., Gasquez, D., Sanshez, M., Rodriguez, L. e Bagur, M. (2002), Un approccio geometrico ai test di robustezza nell'HPLC analitico, LCGC Nord America, 20 , pp. 72-80, www.cromatografiaonline.com .
Lo sviluppo di metodi di misurazione o analitici va di pari passo con lo sviluppo di prodotti farmaceutici.
KPA Group ha scritto: Grazie per il tuo commento, Phil!Gruppo KPA ha scritto:
Grazie per il tuo commento, Phil!
Phil Borman ha scritto: Oltre ai 5 parametri cromatografici...Phil Bormann ha scritto:
Oltre alle 5 risposte di picco cromatografiche studiate, sarebbe stato interessante studiare anche la quantità di ciascuna impurezza quantificata con il metodo analitico. Ciò fornirebbe un'indicazione reale della robustezza in quanto valuterà direttamente l'impatto sul risultato da segnalare. Le variazioni nell'area e nell'altezza del picco possono essere irrilevanti se, ad esempio, le impurità vengono quantificate tramite normalizzazione rispetto al picco principale (la sostanza farmaceutica in cui sono presenti).
