QbD 专栏：QbD 适用于开发分析方法吗？编者注：这篇文章是由@龙克内特和@大卫_s的凯帕集团。 它是一系列博客文章的一部分，称为QbD 专栏。 有关作者的更多信息，请单击上面作者的社区名称。
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测量或分析方法的开发与药品的开发并行。 对过程监测和控制要求的理解推动了分析方法的性能标准，包括过程关键质量属性 (CQA) 和规格限。 揭示需要控制以确保安全性或有效性的原料药特征决定了 CQA 的识别。 分析方法的典型要求包括：
- 精确：此要求确保方法变异性仅占规格范围（规格上限 - 规格下限）的一小部分。 这也称为量具再现性和重复性 (GR&R)。
- 选择性：这决定了在每个生产步骤中监测哪些杂质，并指定了充分区分每种杂质相对比例的设计方法。
- 灵敏度：为了实现有效的过程控制，这需要能够准确反映 CQA 变化的方法，这些变化相对于规格限很重要。
这些标准确立了日常操作中使用的方法的可靠性。 这对分析时间、可接受的溶剂和可用设备都有影响。 要开发具有 QbD 原则的分析方法，必须了解该方法的性能标准以及最终用户所需的操作意图。 对一种方法的了解有限可能会导致技术从实验室转移到商业生产设施或从现有设施转移到新设施的效果不佳。 失败的转移通常需要大量额外资源来纠正失败的原因，通常是在推出新产品面临巨大压力的时候。 将质量源于设计 (QbD) 应用于分析方法旨在防止此类问题。 分析方法开发中的 QbD 实施通常分为四个阶段，涉及方法的设计和控制[1] 。 阶段是：
- 方法设计意图：识别并指定分析方法的性能。
- 方法设计选择：选择实现设计意图的方法工况。
- 方法控制定义：针对对性能变化影响最大的组件建立并定义适当的控制措施。
- 方法控制验证：通过稳健有效的控制展示可接受的方法性能。
测试分析方法的稳健性涉及评估操作条件微小变化的影响[2] 。 耐用性测试是指在不同的实验室、分析人员和仪器等各种正常测试条件下对同一样品进行分析所获得的测试结果的再现性程度。 在下面的案例研究中，我们重点关注使用实验来评估和提高稳健性。
HPLC 开发案例研究
这里介绍的案例研究来自高效液相色谱 (HPLC) 方法的开发[3] 。 这是检验分析方法稳健性的典型例子。 该特定系统由配备可变波长 UV 检测器的 Agilent 1050 和 3396-A 型积分器组成。 稳健性研究的目标是查明与标称操作条件的偏差是否会影响结果。 表 1 列出了本案例研究中使用的因素及其水平。 实验阵列为2 7-4具有三个中心点的分数阶乘实验（参见表 2）。 级别“-1”和“1”对应于表1中列出的下限和上限，“0”对应于标称级别。 选择较低和较高水平以反映正常操作期间标称设置可能自然发生的变化。 有关部分因子实验在配方和药品开发中的 QbD 应用示例，请参阅第二和第三本系列的博客文章。
表格1。 HPLC 实验中的因素和水平。
表 2. HPLC 实验的实验阵列。
实验阵列由 11 次实验运行组成，这些实验运行将设计因素水平组合成一组平衡的组合和三个中心点。
我们可以从 HPLC 实验中学到什么
在分析 HPLC 实验时，我们有以下目标：
- 查找方法推荐设置的预期方法测量预测方差（测量不确定度）。
- 确定实验因素的最佳设置以获得可接受的性能。
- 确定影响方法对一个或多个响应的性能的因素。
- 评估实验因素的变异性对测量响应的影响。
- 通过利用因子效应中的非线性来实现对标称水平变化不敏感的性能，从而使 HPLC 过程变得稳健。
如果我们只考虑 2 个实验中的 8 个实验运行7-4分数阶乘，没有中心点，我们得到的平均预测方差为 0.417，拟合一阶模型的最优性为 100%。 这是由于设计的平衡特性（参见图 1 左）。 表 2 中的设计具有三个中心点，减少了区域中心附近的预测不确定性，并且平均预测方差较低，为 0.38。 然而，中心点对估计斜率没有贡献，如拟合一阶模型的效率较低所示（参见图 1 右侧）。 
图1。 为没有（左）和有（右）三个中心点的分数阶乘设计诊断。
图 2. 没有（顶部）和有（底部）中心点的预测方差分布。
图 2 中的 JMP 预测方差概况显示了各种因子水平组合下的预测方差与误差方差（也称为预测的相对方差）的比率。 相对方差在设计的中心被最小化。 添加三个中心点可将预测方差减少 25%，从 0.12 减少到 0.09。 这是通过在中心点添加实验运行而获得的优势。 我们稍后将看到的另一个优点是中心点允许我们评估非线性效应或线性回归模型的失拟。 第三个优点是中心点为我们提供了对系统自然变化程度的无模型估计。 在每个因子水平组合下，实验产生了五个响应：1) 峰色谱图面积 (peakArea)，2) 峰色谱图高度 (peakHeight)，3) 调整至标准的最小保留时间 (tRmin)，4) 未调整的最小值保留时间 (unad tRmin) 和 5) 色谱图分辨率 (Res)。 我们在分析数据时首先关心的是确定连接因素和响应的正确模型。
通过分析部分析因实验的数据，我们可以学到什么？
线性回归模型是最简单的模型。 它们代表两个因素水平之间响应的变化，在我们的例子中，这对应于标记为“-1”和“+1”的水平。 由于我们还有三个中心点，在标记为“0”的水平上，我们还可以评估非线性效应。 正如我们的第二篇博客文章中那样，我们通过添加一个综合指标变量来评估失拟度 (LOF)，该变量在中心点等于“1”，在其他地方等于“0”。 图 3 显示了对所有七个因素和 LOF 指标均具有线性影响的所有五个响应的 JMP 效果摘要报告。 
图 3. 七个因素和五个响应的 LOF 指标的效果总结报告。
效果摘要表列出了整个五个响应集的模型效果，按升序 p 值排序。 每个效应的 LogWorth 定义为 -log10(p 值)，它调整 p 值以为图形提供适当的比例。 超过 2 的 LogWorth 在 0.01 水平上显着，因为 -log10(0.01)=2。 该报告包括一个 LogWorth 条形图，在整数值处带有垂直虚线，在 2 处有一条蓝色参考线。 显示的 p 值对应于模型报告的效果检验表中显示的显着性检验。 图 3 中的报告显示，总体而言，四个因素和 LOF 在 0.01 水平上显着（Col Temp、Gradient、Buf PH 和 Dim Perc），而 Buf Conc、Det Wave 和 Trie Perc 则不显着。 从表2的实验计划中，可以用线性模型估计七个因素和LOF指标对五个响应的主要影响。 图 4 显示了调整 R 后的peakHeight 参数估计值2 93%，非常合适。 PeakHeight 响应对 Col Temp、Det Wave 和 Gradient 的变化最为敏感。
图 4. 利用线性模型对七个因素的peakHeight和LOF指标进行参数估计。 为了提高可读性，peakHeights 已除以 1000。
我们观察到实验设计中心点的预测值与实际执行的三个测量值（通过 LOF 变量）之间存在统计显着差异。 图 5 显示了一个刻画器图，显示了每个因素对所有五个响应的线性影响。该图对于突出显示哪些条件可能影响 HPLC 方法非常有帮助。 我们看到，Col Temp 和 Gradient 这两个最重要的因素会影响几种不同的响应。Buf pH、Buf Conc 和 Dim Perc 对保留反应具有特别强的影响，但对其他 CQA 的影响较弱。这些因子非常适合保留响应和 PeakHeight，但不适用于 PeakArea 或 Res，这反映在这些 CQA 的宽置信带以及方差分析线中整体模型 F 检验的高 p 值中模型输出。
图 5. 使用线性模型的 HPLC 实验分析器。
对于非线性我们应该做什么？ 我们的分析发现 LOF 指标有显着影响，这表明图 5 的刻画器中未考虑到非线性效应。 我们添加到两级部分因子设计中的中心点让我们可以检测非线性，但它们没有提供足够的信息来确定导致非线性的原因 - 七个因素中的任何一个（也可能是其中几个）都可能导致非线性对峰值高度的非线性影响。在我们的下一篇博客中，我们将讨论一些解决该问题的设计选项。 现在，我们展示当前实验所取得的成果。 经过多次头脑风暴，HPLC 团队认为梯度很可能是导致非线性的因素。 这一仅基于过程知识的重要假设对于我们随后的所有结论至关重要。我们继续将模型与原始实验数据进行拟合，其中包括梯度的二次效应。 该团队还决定只保留对每个响应具有最强主效应的因素；对于peakHeight，因素是梯度、柱温和检测波长。 在图 6 中，我们显示了将该简化模型拟合到 PeakHeight 响应的参数估计值。 在此模型中，所有项均具有调整后的 R 值2 89%。均方根误差（用于估计相同因子设置下的运行间变化）为 1.754，略小于peakHeight 本身大小的 1%（将peakHeight 除以1000 后）。
图 6. 使用二次模型对peakHeight 进行参数估计。 为了提高可读性，peakHeights 已除以 1000。
我们在图 7 中展示了简化二次模型的探查器。 
图 7. 具有峰高简化二次模型的 HPLC 实验分析器。 为了提高可读性，peakHeights 已除以 1000。
寻找稳健的解决方案
该实验的主要目标之一是评估系统对输入因素变化的鲁棒性。 我们通过向简化二次模型中的四个因子引入正态噪声来探讨这个问题。 对于这三个因素中的每一个，我们假设标准差为 0.4（以编码单位表示），这是 JMP 中的默认选项。 这反映了一种观点，即实验设置与标称水平相差约 2.5 个 SD，因此反映了实践中可能遇到的相当极端的偏差。 图 8 显示了噪声对中心点设置的 PeakHeight 的影响，该中心点最初被确定为标称设置。我们可以通过将模拟结果保存到表格并使用 JMP 中的“分布”选项卡来计算模拟结果的 SD。 结果 SD 为 2.397，略大于我们之前计算的逐次运行 SD 1.754。 与分析系统相关的整体 SD 涉及这两个部分。 为了组合它们，我们需要首先对它们进行平方，然后将它们相加（因为方差是相加的，而不是SD），然后取平方根以返回到原始测量尺度。 所得组合 SD 为 2.970，因此因子设置的预期变化导致 SD 比单独运行间变化的 SD 大约 70%。总体 SD 小于 PeakHeight 典型值的 1.5%，这对于该过程来说是可以接受的。
我们的标称解决方案是否具有稳健性？
图8对于回答这个问题非常有帮助。 这里的重要因素是梯度，它与峰高的非线性关系。 该关系的“谷”接近名义选择 0。 我们对因子变化的模拟生成覆盖范围从 -1 到 1 的梯度值。 当这些值位于谷值时，它们向peakHeight传递的变化非常小。 相比之下，当它们接近极值时，peakHeight 会有很大的变化。 因此，谷底接近标称设置的事实确保了传输的变化将尽可能小。 我们可以通过改变 Gradient 的名义值来测试这个特性。 当标称值为 -0.5 时，模拟器显示因子变化的 SD 增加到 4.282，几乎比标称设置为 0 时高出 80%。 PeakHeight 对 Col Temp 和 Det Wave 的依赖性是线性的。 因此，无论我们如何选择这些因素的标称设置，它们都会将相同程度的变化传输到 PeakHeight 输出。 该实验让我们评估它们如何影响稳健性，但没有提供任何利用结果来提高稳健性的机会。
图 8. 当因子处于标称设置并且自然 SD 为 0.4 时，peakHeight 的预测刻画器。 为了提高可读性，peakHeights 已除以 1000。
回到最初的问题
回顾最初提出的问题，我们现在可以提供以下答案：
1. 推荐的方法设置的预期方法测量预测方差是多少（测量不确定度）。
回答：我们最仔细地研究了这个问题的peakHeight，我们发现SD是2970，运行间变化和测量过程因素变化的贡献大致相等。
2. 什么样的实验因素设置才能达到可接受的性能？
回答：所有因子均处于标称设置（编码值为 0）时，2970 的 SD 小于测量值大小的 1.5%，这是本应用中可接受的变化水平。
3. 在一个或多个响应中影响方法性能的因素有哪些？
回答：对方法性能影响最大的三个因素是梯度曲线、柱温和检测波。
4. 我们能否使实验因素的设置更加稳健，以实现对因素水平变化不敏感的性能？
回答：我们发现，我们可以通过将梯度设置为编码级别 0（实验中的标称级别）来提高 PeakHeight 的鲁棒性。 该设置有助于我们利用梯度的非线性效应并减少传输的变化。
5. 我们能否评估实验因素的变异性对分析方法的影响？
回答：正如我们之前指出的，输入因素的自然变化是导致 PeakHeight 变化略多于一半的原因。
包起来
在回顾最初提出的问题时，我们首先拟合线性回归模型。 在意识到存在未考虑的非线性效应后，我们使用了简化的二次模型，并发现它与数据拟合得很好。 引入约简二次方因素（梯度曲线、柱温和检测波）的变异性，我们可以估计由于该方法引起的变异性，并可以评估推荐设置的稳健性。 该团队关于梯度导致非线性的假设在这里显然很重要。 如果其他因素也具有非线性影响，则可能会对如何最好地提高方法的鲁棒性产生影响。 我们将在下一篇博客文章中进一步探讨这个问题。
笔记
[1]博尔曼，P.， 内瑟科特，P.， 查特菲尔德，M.， 汤普森，D.， Truman, K. (2007)，制药技术。 http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[2] Kenett, RS 和 Kenett, DA (2008)，质量源于设计在生物仿制药技术产品中的应用,认证和质量保证，Springer Verlag，卷。 13，第 12 期，第 681-690 页。
[3]罗梅罗河， 加斯奎兹，D.， 桑谢斯，M.， Rodriguez, L. 和 Bagur, M. (2002)，分析 HPLC 稳健性测试的几何方法，LCGC 北美， 20 ，第 72-80 页， www.chromatographyonline.com 。
测量或分析方法的开发与药品的开发并行。
KPA Group 写道: 感谢您的评论，菲尔！凯帕集团写道：
感谢您的评论，菲尔！
Phil Borman 写道： 除了 5 种色谱法...菲尔·博尔曼写道：
除了研究 5 个色谱峰响应之外，研究通过分析方法定量的每种杂质的量也很有趣。 这将为您提供稳健性的真实指示，因为它将直接评估对可报告结果的影响。 例如，如果通过针对主峰（它们所在的药物物质）进行归一化来定量杂质，则峰面积和峰高的变化可能无关紧要。
