QbD 專欄：QbD 適用於開發分析方法嗎？編者註：這篇文章是由@龍克內特和@大衛_s的凱帕集團。 它是一系列博客文章的一部分，稱為QbD 專欄。 有關作者的更多信息，請單擊上面作者的社區名稱。
Ron KenettRon KenettRon KenettRon Kenett羅恩·肯尼特
David SteinbergDavid SteinbergDavid SteinbergDavid Steinberg大衛·斯坦伯格
測量或分析方法的開發與藥品的開發並行。 對過程監測和控制要求的理解推動了分析方法的性能標準，包括過程關鍵質量屬性 (CQA) 和規格限。 揭示需要控制以確保安全性或有效性的原料藥特徵決定了 CQA 的識別。 分析方法的典型要求包括：
- 精確：此要求確保方法變異性僅佔規格範圍（規格上限 - 規格下限）的一小部分。 這也稱為量具再現性和重複性 (GR&R)。
- 選擇性：這決定了在每個生產步驟中監測哪些雜質，並指定了充分區分每種雜質相對比例的設計方法。
- 靈敏度：為了實現有效的過程控制，這需要能夠準確反映 CQA 變化的方法，這些變化相對於規格限很重要。
這些標準確立了日常操作中使用的方法的可靠性。 這對分析時間、可接受的溶劑和可用設備都有影響。 要開發具有 QbD 原則的分析方法，必須了解該方法的性能標準以及最終用戶所需的操作意圖。 對一種方法的了解有限可能會導致技術從實驗室轉移到商業生產設施或從現有設施轉移到新設施的效果不佳。 失敗的轉移通常需要大量額外資源來糾正失敗的原因，通常是在推出新產品面臨巨大壓力的時候。 將質量源於設計 (QbD) 應用於分析方法旨在防止此類問題。 分析方法開發中的 QbD 實施通常分為四個階段，涉及方法的設計和控制[1] 。 階段是：
- 方法設計意圖：識別並指定分析方法的性能。
- 方法設計選擇：選擇實現設計意圖的方法工況。
- 方法控制定義：針對對性能變化影響最大的組件建立並定義適當的控制措施。
- 方法控制驗證：通過穩健有效的控制展示可接受的方法性能。
測試分析方法的穩健性涉及評估操作條件微小變化的影響[2] 。 耐用性測試是指在不同的實驗室、分析人員和儀器等各種正常測試條件下對同一樣品進行分析所獲得的測試結果的再現性程度。 在下面的案例研究中，我們重點關注使用實驗來評估和提高穩健性。
HPLC 開發案例研究
這裡介紹的案例研究來自高效液相色譜 (HPLC) 方法的開發[3] 。 這是檢驗分析方法穩健性的典型例子。 該特定係統由配備可變波長 UV 檢測器的 Agilent 1050 和 3396-A 型積分器組成。 穩健性研究的目標是查明與標稱操作條件的偏差是否會影響結果。 表 1 列出了本案例研究中使用的因素及其水平。 實驗陣列為2 7-4具有三個中心點的分數階乘實驗（參見表 2）。 級別“-1”和“1”對應於表1中列出的下限和上限，“0”對應於標稱級別。 選擇較低和較高水平以反映正常操作期間標稱設置可能自然發生的變化。 有關部分因子實驗在配方和藥品開發中的 QbD 應用示例，請參閱第二和第三本系列的博客文章。
表格1。 HPLC 實驗中的因素和水平。
表 2. HPLC 實驗的實驗陣列。
實驗陣列由 11 次實驗運行組成，這些實驗運行將設計因素水平組合成一組平衡的組合和三個中心點。
我們可以從 HPLC 實驗中學到什麼
在分析 HPLC 實驗時，我們有以下目標：
- 查找方法推薦設置的預期方法測量預測方差（測量不確定度）。
- 確定實驗因素的最佳設置以獲得可接受的性能。
- 確定影響方法對一個或多個響應的性能的因素。
- 評估實驗因素的變異性對測量響應的影響。
- 通過利用因子效應中的非線性來實現對標稱水平變化不敏感的性能，從而使 HPLC 過程變得穩健。
如果我們只考慮 2 個實驗中的 8 個實驗運行7-4分數階乘，沒有中心點，我們得到的平均預測方差為 0.417，擬合一階模型的最優性為 100%。 這是由於設計的平衡特性（參見圖 1 左）。 表 2 中的設計具有三個中心點，減少了區域中心附近的預測不確定性，並且平均預測方差較低，為 0.38。 然而，中心點對估計斜率沒有貢獻，如擬合一階模型的效率較低所示（參見圖 1 右側）。 
圖1。 為沒有（左）和有（右）三個中心點的分數階乘設計診斷。
圖 2. 沒有（頂部）和有（底部）中心點的預測方差分佈。
圖 2 中的 JMP 預測方差概況顯示了各種因子水平組合下的預測方差與誤差方差（也稱為預測的相對方差）的比率。 相對方差在設計的中心被最小化。 添加三個中心點可將預測方差減少 25%，從 0.12 減少到 0.09。 這是通過在中心點添加實驗運行而獲得的優勢。 我們稍後將看到的另一個優點是中心點允許我們評估非線性效應或線性回歸模型的失擬。 第三個優點是中心點為我們提供了對系統自然變化程度的無模型估計。 在每個因子水平組合下，實驗產生了五個響應：1) 峰色譜圖面積(peakArea)，2) 峰色譜圖高度(peakHeight)，3) 調整至標準的最小保留時間(tRmin)，4)未調整的最小值保留時間 (unad tRmin) 和 5) 色譜圖分辨率 (Res)。 我們在分析數據時首先關心的是確定連接因素和響應的正確模型。
通過分析部分析因實驗的數據，我們可以學到什麼？
線性回歸模型是最簡單的模型。 它們代表兩個因素水平之間響應的變化，在我們的例子中，這對應於標記為“-1”和“+1”的水平。 由於我們還有三個中心點，在標記為“0”的水平上，我們還可以評估非線性效應。 正如我們的第二篇博客文章中那樣，我們通過添加一個綜合指標變量來評估失擬度 (LOF)，該變量在中心點等於“1”，在其他地方等於“0”。 圖 3 顯示了對所有七個因素和 LOF 指標均具有線性影響的所有五個響應的 JMP 效果摘要報告。 
圖 3. 七個因素和五個響應的 LOF 指標的效果總結報告。
效果摘要表列出了整個五個響應集的模型效果，按升序 p 值排序。 每個效應的 LogWorth 定義為 -log10(p 值)，它調整 p 值以為圖形提供適當的比例。 超過 2 的 LogWorth 在 0.01 水平上顯著，因為 -log10(0.01)=2。 該報告包括一個 LogWorth 條形圖，在整數值處帶有垂直虛線，在 2 處有一條藍色參考線。 顯示的 p 值對應於模型報告的效果檢驗表中顯示的顯著性檢驗。 圖 3 中的報告顯示，總體而言，四個因素和 LOF 在 0.01 水平上顯著（Col Temp、Gradient、Buf PH 和 Dim Perc），而 Buf Conc、Det Wave 和 Trie Perc 則不顯著。 從表2的實驗計劃中，可以用線性模型估計七個因素和LOF指標對五個響應的主要影響。 圖 4 顯示了調整 R 後的peakHeight 參數估計值2 93%，非常合適。 PeakHeight 響應對 Col Temp、Det Wave 和 Gradient 的變化最為敏感。
圖 4. 利用線性模型對七個因素的peakHeight和LOF指標進行參數估計。 為了提高可讀性，peakHeights 已除以 1000。
我們觀察到實驗設計中心點的預測值與實際執行的三個測量值（通過 LOF 變量）之間存在統計顯著差異。 圖 5 顯示了一個刻畫器圖，顯示了每個因素對所有五個響應的線性影響。該圖對於突出顯示哪些條件可能影響 HPLC 方法非常有幫助。 我們看到，Col Temp 和 Gradient 這兩個最重要的因素會影響幾種不同的響應。Buf pH、Buf Conc 和 Dim Perc 對保留反應具有特別強的影響，但對其他 CQA 的影響較弱。這些因子非常適合保留響應和 PeakHeight，但不適用於 PeakArea 或 Res，這反映在這些 CQA 的寬置信帶以及方差分析線中整體模型 F 檢驗的高 p 值中模型輸出。
圖 5. 使用線性模型的 HPLC 實驗分析器。
對於非線性我們應該做什麼？ 我們的分析發現 LOF 指標有顯著影響，這表明圖 5 的刻畫器中未考慮到非線性效應。 我們添加到兩級部分因子設計中的中心點讓我們可以檢測非線性，但它們沒有提供足夠的信息來確定導致非線性的原因- 七個因素中的任何一個（也可能是其中幾個）都可能導致非線性對峰值高度的非線性影響。在我們的下一篇博客中，我們將討論一些解決該問題的設計選項。 現在，我們展示當前實驗所取得的成果。 經過多次頭腦風暴，HPLC 團隊認為梯度很可能是導致非線性的因素。 這一僅基於過程知識的重要假設對於我們隨後的所有結論至關重要。我們繼續將模型與原始實驗數據進行擬合，其中包括梯度的二次效應。 該團隊還決定只保留對每個響應具有最強主效應的因素；對於peakHeight，因素是梯度、柱溫和檢測波長。 在圖 6 中，我們顯示了將該簡化模型擬合到 PeakHeight 響應的參數估計值。 在此模型中，所有項均具有調整後的 R 值2 89%。均方根誤差用於估計相同因子設置下的運行間變化，為 1.754，略小於peakHeight 本身大小的 1%（將peakHeight 除以1000 後）。
圖 6. 使用二次模型對peakHeight 進行參數估計。 為了提高可讀性，peakHeights 已除以 1000。
我們在圖 7 中展示了簡化二次模型的探查器。 
圖 7. 具有峰高簡化二次模型的 HPLC 實驗分析器。 為了提高可讀性，peakHeights 已除以 1000。
尋找穩健的解決方案
該實驗的主要目標之一是評估系統對輸入因素變化的魯棒性。 我們通過向簡化二次模型中的四個因子引入正態噪聲來探討這個問題。 對於這三個因素中的每一個，我們假設標準差為 0.4（以編碼單位表示），這是 JMP 中的默認選項。 這反映了一種觀點，即實驗設置與標稱水平相差約 2.5 個 SD，因此反映了實踐中可能遇到的相當極端的偏差。 圖 8 顯示了噪聲對中心點設置的 PeakHeight 的影響，該中心點最初被確定為標稱設置。我們可以通過將模擬結果保存到表格並使用 JMP 中的“分佈”選項卡來計算模擬結果的 SD。 結果 SD 為 2.397，略大於我們之前計算的逐次運行 SD 1.754。 與分析系統相關的整體 SD 涉及這兩個部分。 為了組合它們，我們需要首先對它們進行平方，然後將它們相加（因為方差是相加的，而不是SD），然後取平方根以返回到原始測量尺度。 所得組合 SD 為 2.970，因此因子設置的預期變化導致 SD 比單獨運行間變化的 SD 大 70% 左右。總體 SD 小於 PeakHeight 典型值的 1.5%，這對於該過程來說是可以接受的。
我們的標稱解決方案是否具有穩健性？
圖8對於回答這個問題非常有幫助。 這裡的重要因素是梯度，它與峰高的非線性關係。 該關係的“谷”接近名義選擇 0。 我們對因子變化的模擬生成覆蓋範圍從 -1 到 1 的梯度值。 當這些值位於谷值時，它們向peakHeight傳遞的變化非常小。 相比之下，當它們接近極值時，peakHeight 會有很大的變化。 因此，谷底接近標稱設置的事實確保了傳輸的變化將盡可能小。 我們可以通過改變 Gradient 的名義值來測試這個特性。 當標稱值為 -0.5 時，模擬器顯示因子變化的 SD 增加到 4.282，幾乎比標稱設置為 0 時高出 80%。 PeakHeight 對 Col Temp 和 Det Wave 的依賴性是線性的。 因此，無論我們如何選擇這些因素的標稱設置，它們都會將相同程度的變化傳輸到 PeakHeight 輸出。 該實驗讓我們評估它們如何影響穩健性，但沒有提供任何利用結果來提高穩健性的機會。
圖 8. 當因子處於標稱設置並且自然 SD 為 0.4 時，peakHeight 的預測刻畫器。 為了提高可讀性，peakHeights 已除以 1000。
回到最初的問題
回顧最初提出的問題，我們現在可以提供以下答案：
1. 推薦的方法設置的預期方法測量預測方差是多少（測量不確定度）。
回答：我們最仔細地研究了這個問題的peakHeight，我們發現SD是2970，運行間變化和測量過程因素變化的貢獻大致相等。
2. 什麼樣的實驗因素設置才能達到可接受的性能？
回答：所有因子均處於標稱設置（編碼值為 0）時，2970 的 SD 小於測量值大小的 1.5%，這是本應用中可接受的變化水平。
3. 在一個或多個響應中影響方法性能的因素有哪些？
回答：對方法性能影響最大的三個因素是梯度曲線、柱溫和檢測波。
4. 我們能否使實驗因素的設置更加穩健，以實現對因素水平變化不敏感的性能？
回答：我們發現，我們可以通過將梯度設置為編碼級別 0（實驗中的標稱級別）來提高 PeakHeight 的魯棒性。 該設置有助於我們利用梯度的非線性效應並減少傳輸的變化。
5. 我們能否評估實驗因素的變異性對分析方法的影響？
回答：正如我們之前指出的，輸入因素的自然變化是導致 PeakHeight 變化略多於一半的原因。
包起來
在回顧最初提出的問題時，我們首先擬合線性回歸模型。 在意識到存在未考慮的非線性效應後，我們使用了簡化的二次模型，並發現它與數據擬合得很好。 引入約簡二次方因素（梯度曲線、柱溫和檢測波）的變異性，我們可以估計由於該方法引起的變異性，並可以評估推薦設置的穩健性。 該團隊關於梯度導致非線性的假設在這裡顯然很重要。 如果其他因素也具有非線性影響，則可能會對如何最好地提高方法的魯棒性產生影響。 我們將在下一篇博客文章中進一步探討這個問題。
筆記
[1]博爾曼，P.， 內瑟科特，P.， 查特菲爾德，M.， 湯普森，D.， Truman, K. (2007)，製藥技術。 http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[2] Kenett, RS 和 Kenett, DA (2008)，質量源於設計在生物仿製藥技術產品中的應用,認證和質量保證，Springer Verlag，卷。 13，第 12 期，第 681-690 頁。
[3]羅梅羅河， 加斯奎茲，D.， 桑謝斯，M.， Rodriguez, L. 和 Bagur, M. (2002)，分析 HPLC 穩健性測試的幾何方法，LCGC 北美， 20 ，第 72-80 頁， www.chromatographyonline.com 。
測量或分析方法的開發與藥品的開發並行。
KPA Group 寫道: 感謝您的評論，菲爾！凱帕集團寫道：
感謝您的評論，菲爾！
Phil Borman 寫道： 除了 5 種色譜法...菲爾·博爾曼寫道：
除了研究 5 個色譜峰響應之外，研究通過分析方法定量的每種雜質的量也很有趣。 這將為您提供穩健性的真實指示，因為它將直接評估對可報告結果的影響。 例如，如果通過針對主峰（它們所在的藥物物質）進行歸一化來定量雜質，則峰面積和峰高的變化可能無關緊要。
