La columna QbD: ¿QbD es aplicable para desarrollar métodos analíticos?Nota del editor: Esta publicación es de @ronkenett y @david_s del Grupo KPA . Es parte de una serie de publicaciones de blog llamadas La columna QbD . Para obtener más información sobre los autores, haga clic en los nombres de las comunidades de los autores arriba.
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El desarrollo de métodos de medición o análisis va paralelo al desarrollo de productos farmacéuticos. La comprensión de los requisitos de control y monitoreo del proceso impulsa los criterios de desempeño para los métodos analíticos, incluidos los atributos de calidad críticos del proceso (CQA) y los límites de especificación. Descubrir las características de un fármaco que requieren control para garantizar su seguridad o eficacia determina la identificación de las CQA. Los requisitos típicos de los métodos analíticos incluyen:
- Precisión: Este requisito garantiza que la variabilidad del método sea solo una pequeña proporción del rango de especificaciones (límite de especificación superior – límite de especificación inferior). Esto también se llama Reproducibilidad y Repetibilidad Gage (GR&R).
- Selectividad: Esto determina qué impurezas monitorear en cada paso de producción y especifica métodos de diseño que discriminan adecuadamente las proporciones relativas de cada impureza.
- Sensibilidad: Para lograr un control eficaz del proceso, se requieren métodos que reflejen con precisión los cambios en los CQA que son importantes en relación con los límites de especificación.
Estos criterios establecen la confiabilidad de los métodos para su uso en operaciones de rutina. Esto tiene implicaciones para el tiempo de análisis, los solventes aceptables y el equipo disponible. Para desarrollar un método analítico con principios QbD, se deben comprender los criterios de desempeño del método, así como la intención operativa deseada del eventual usuario final. La comprensión limitada de un método puede conducir a una mala transferencia de tecnología desde el laboratorio para su uso en instalaciones de fabricación comerciales o desde una instalación existente a una nueva. Las transferencias fallidas a menudo requieren importantes recursos adicionales para remediar las causas del fracaso, generalmente en un momento en que existe una presión considerable para seguir adelante con el lanzamiento de un nuevo producto. La aplicación de Calidad por Diseño (QbD) a los métodos analíticos tiene como objetivo prevenir estos problemas. La implementación de QbD en el desarrollo de métodos analíticos suele ser un proceso de cuatro etapas, que aborda tanto el diseño como el control de los métodos. [1] . Las etapas son:
- Intención del diseño del método : Identificar y especificar el rendimiento del método analítico.
- Selección de diseño del método : Seleccione las condiciones de trabajo del método para lograr la intención del diseño.
- Definición de control de método : Establecer y definir controles apropiados para los componentes con mayores contribuciones a la variabilidad del desempeño.
- Validación del control del método : Demostrar un rendimiento aceptable del método con controles sólidos y eficaces.
Probar la solidez de los métodos analíticos implica evaluar la influencia de pequeños cambios en las condiciones operativas. [2] . Las pruebas de robustez identifican el grado de reproducibilidad de los resultados de las pruebas obtenidos mediante el análisis de la misma muestra en diversas condiciones de prueba normales, como diferentes laboratorios, analistas e instrumentos. En el siguiente estudio de caso, nos centramos en el uso de experimentos para evaluar y mejorar la robustez.
Un estudio de caso en el desarrollo de HPLC
El estudio de caso presentado aquí proviene del desarrollo de un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). [3] . Es un ejemplo típico de prueba de la solidez de los métodos analíticos. El sistema específico consta de un Agilent 1050, con un detector UV de longitud de onda variable y un integrador modelo 3396-A. El objetivo del estudio de robustez es descubrir si las desviaciones de las condiciones operativas nominales afectan los resultados. La Tabla 1 enumera los factores y sus niveles utilizados en este estudio de caso. La matriz experimental es un 2 7-4 Experimento factorial fraccional con tres puntos centrales (ver Tabla 2). Los niveles "-1" y "1" corresponden a los niveles inferior y superior enumerados en la Tabla 1, y "0" corresponde al nivel nominal. Los niveles inferior y superior se eligen para reflejar la variación que podría ocurrir naturalmente con respecto al ajuste nominal durante el funcionamiento normal. Para ver ejemplos de aplicaciones QbD de experimentos factoriales fraccionarios para la formulación y el desarrollo de productos farmacéuticos, consulte el segundo y tercero publicaciones de blog de esta serie.
Tabla 1. Factores y niveles en el experimento de HPLC.
Tabla 2. Conjunto experimental del experimento HPLC.
El conjunto experimental consta de 11 corridas experimentales que combinan los niveles de los factores de diseño en un conjunto equilibrado de combinaciones y tres puntos centrales.
Lo que podemos aprender de los experimentos de HPLC
Al analizar el experimento de HPLC, tenemos los siguientes objetivos:
- Encuentre la variación esperada de la predicción de la medición del método para las configuraciones recomendadas del método (la incertidumbre de la medición).
- Identificar la mejor configuración de los factores experimentales para lograr un rendimiento aceptable.
- Determine los factores que impactan el desempeño del método en una o más respuestas.
- Evaluar el impacto de la variabilidad de los factores experimentales en las respuestas medidas.
- Robustece el proceso de HPLC aprovechando la no linealidad en los efectos de los factores para lograr un rendimiento que no sea sensible a los cambios en los niveles nominales.
Si consideramos sólo las ocho corridas experimentales de los 2 7-4 factorial fraccional, sin los puntos centrales, obtenemos una varianza de predicción promedio de 0,417 y un óptimo del 100% para ajustar un modelo de primer orden. Esto se debe a la propiedad equilibrada del diseño (ver Figura 1 a la izquierda). El diseño de la Tabla 2, con tres puntos centrales, reduce la incertidumbre de la predicción cerca del centro de la región y tiene una varianza de predicción promedio más baja de 0,38. Sin embargo, los puntos centrales no contribuyen a estimar las pendientes, como se ve en la menor eficiencia para ajustar el modelo de primer orden (ver Figura 1 derecha). 
Figura 1. Diseñe diagnósticos para este factorial fraccionado sin (izquierda) y con (derecha) tres puntos centrales.
Figura 2. Perfil de varianza de predicción sin (arriba) y con puntos centrales (abajo).
El perfil de varianza de predicción de JMP en la Figura 2 muestra la relación entre la varianza de predicción y la varianza de error, también llamada varianza relativa de predicción, en varias combinaciones de niveles de factores. La variación relativa se minimiza en el centro del diseño. Agregar tres puntos centrales reduce la varianza de la predicción en un 25 %, de 0,12 a 0,09. Esta es una ventaja que se obtiene al agregar carreras experimentales en los puntos centrales. Otra ventaja que veremos más adelante es que los puntos centrales nos permiten evaluar efectos no lineales o falta de ajuste del modelo de regresión lineal. Una tercera ventaja es que los puntos centrales nos dan una estimación sin modelo del alcance de la variación natural en el sistema. En cada combinación de niveles de factor, los experimentos produjeron cinco respuestas: 1) Área del cromatograma en el pico (peakArea), 2) Altura del cromatograma en el pico (peakHeight), 3) Tiempo de retención mínimo ajustado al estándar (tRmin), 4) Mínimo no ajustado tiempo de retención (unad tRmin) y 5) Resolución del cromatograma (Res). Nuestra primera preocupación al analizar los datos es identificar modelos adecuados que vinculen factores y respuestas.
¿Qué aprendemos al analizar los datos del experimento factorial fraccionario?
Los modelos de regresión lineal son los modelos más simples de considerar. Representan cambios en las respuestas entre dos niveles de factores; en nuestro caso, esto corresponde a los niveles denominados "-1" y "+1". Como también tenemos tres puntos centrales, en niveles denominados "0", también podemos evaluar efectos no lineales. Lo hacemos, como en nuestra segunda publicación de blog, agregando una variable indicadora sintética diseñada para evaluar la falta de ajuste (LOF) que es igual a "1" en los puntos centrales y "0" en otros lugares. En la Figura 3 se presenta el informe Resumen de efectos del JMP, para las cinco respuestas con efectos lineales en los siete factores y el indicador LOF. 
Figura 3. Informe resumido del efecto de siete factores e indicador LOF en cinco respuestas.
La tabla Resumen de efectos enumera los efectos del modelo en el conjunto completo de cinco respuestas, ordenados por valores p ascendentes. El LogWorth para cada efecto se define como -log10(valor p), que ajusta los valores p para proporcionar una escala adecuada para los gráficos. Un LogWorth que excede 2 es significativo en el nivel 0,01 porque -log10(0,01)=2. El informe incluye un gráfico de barras del LogWorth con líneas verticales discontinuas en valores enteros y una línea de referencia azul en 2. Los valores p mostrados corresponden a la prueba de significancia mostrada en la tabla Pruebas de efecto del informe del modelo. El informe de la Figura 3 muestra que, en general, cuatro factores y LOF son significativos al nivel 0,01 (Col Temp, Gradient, Buf PH y Dim Perc) y Buf Conc, Det Wave y Trie Perc no son significativos. A partir del plan experimental de la Tabla 2, se pueden estimar los efectos principales de los siete factores y el indicador LOF en las cinco respuestas con un modelo lineal. La Figura 4 presenta estimaciones de parámetros para PeakHeight con una R ajustada 2 del 93%, un muy buen ajuste. La respuesta PeakHeight es más sensible a las variaciones en Col Temp, Det Wave y Gradient.
Figura 4. Estimaciones de parámetros de altura máxima de siete factores e indicador LOF con modelo lineal. Para mejorar la legibilidad, las alturas máximas se han dividido entre 1000.
Observamos una diferencia estadísticamente significativa entre el valor predicho en el punto central del diseño experimental y las tres mediciones realmente realizadas allí (a través de la variable LOF). La Figura 5 muestra un gráfico de perfil que muestra los efectos lineales de cada factor en las cinco respuestas.El gráfico es muy útil para resaltar qué condiciones podrían afectar el método HPLC. Vemos que Col Temp y Gradient, los dos factores más importantes, afectan varias respuestas diferentes.Buf pH, Buf Conc y Dim Perc tienen efectos especialmente fuertes sobre las respuestas de retención, pero tienen efectos débiles sobre los otros CQA.Los factores dan buenos ajustes a las respuestas de retención y a PeakHeight, pero no a PeakArea o Res, lo que se refleja en las amplias bandas de confianza para esos CQA y en altos valores de p para las pruebas F del modelo general en la línea de Análisis de Varianza. de la salida del modelo.
Figura 5. Perfilador de experimentos de HPLC con modelo lineal.
¿Qué debemos hacer con la no linealidad? Nuestro análisis encontró un efecto significativo del indicador LOF, lo que apunta a un efecto no lineal que no se tiene en cuenta en el perfilador de la Figura 5. Los puntos centrales que agregamos al diseño factorial fraccional de dos niveles nos permiten detectar la no linealidad, pero no brindan suficiente información para determinar qué la causa: cualquiera de los siete factores (y posiblemente varios de ellos) podrían ser responsables de el efecto no lineal sobre la altura máxima.En nuestro próximo blog, discutiremos algunas opciones de diseño para abordar el problema. Por ahora, mostramos lo que logramos con el experimento actual. Después de mucha lluvia de ideas, el equipo de HPLC decidió que era muy probable que el gradiente fuera el factor que causaba la no linealidad. Esta importante suposición, basada únicamente en el conocimiento del proceso, es crucial para todas nuestras conclusiones posteriores.Procedimos a ajustar un modelo a los datos experimentales originales que incluye un efecto cuadrático para Gradient. El equipo también decidió retener sólo los factores con los efectos principales más fuertes para cada respuesta; para PeakHeight, los factores fueron gradiente, temperatura de columna y longitud de onda de detección. En la Figura 6, mostramos estimaciones de parámetros al ajustar este modelo reducido a las respuestas de altura máxima. Con este modelo, todos los términos son significativos con una R ajustada 2 del 89%.El error cuadrático medio, que estima la variación entre ejecuciones con la misma configuración de los factores, es 1,754, un poco menos del 1% de la magnitud de PeakHeight en sí (después de dividir PeakHeight por 1000).
Figura 6. Estimaciones de parámetros de altura pico con modelo cuadrático. Para mejorar la legibilidad, las alturas máximas se han dividido entre 1000.
Mostramos un Profiler para el modelo cuadrático reducido en la Figura 7. 
Figura 7. Perfilador del experimento de HPLC con modelo cuadrático reducido para altura máxima. Para mejorar la legibilidad, las alturas máximas se han dividido entre 1000.
Encontrar una solución sólida
Uno de los principales objetivos del experimento fue evaluar la robustez del sistema ante la variación de los factores de entrada. Exploramos esta cuestión introduciendo ruido normal en los cuatro factores del modelo cuadrático reducido. Para cada uno de los tres factores, asumimos una desviación estándar de 0,4 (en las unidades codificadas), que es la opción predeterminada en JMP. Esto refleja la opinión de que los ajustes experimentales están aproximadamente a 2,5 DE del nivel nominal, por lo que reflejan desviaciones bastante extremas que podrían encontrarse en la práctica. La Figura 8 presenta el efecto del ruido en la altura máxima para una configuración en el punto central que inicialmente se identificó como la configuración nominal.Podemos calcular la DE de los resultados simulados guardándolos en una tabla y usando la pestaña "distribución" en JMP. La DE resulta ser 2,397 y es ligeramente mayor que la DE entre ejecuciones que calculamos anteriormente de 1,754. El DS general asociado con el sistema analítico involucra ambos componentes. Para combinarlas, primero debemos elevarlas al cuadrado, luego sumarlas (porque las varianzas son aditivas, no SD) y luego sacar una raíz cuadrada para volver a la escala de medición original. La DE combinada resultante es 2,970, por lo que la variación anticipada en la configuración de los factores conduce a una DE aproximadamente un 70% mayor que la de la variación entre series únicamente.La DE general es inferior al 1,5 % de los valores típicos de altura pico y eso se consideró aceptable para este proceso.
¿Nuestra solución nominal es buena en términos de robustez?
La Figura 8 es muy útil para responder esta pregunta. El factor importante aquí es el gradiente, a través de su relación no lineal con PeakHeight. El “valle” de esa relación está cerca de la elección nominal de 0. Nuestra simulación de variación de factores genera valores de gradiente que cubren el rango de -1 a 1. Cuando esos valores están en el valle, transmiten muy poca variación a PeakHeight. Por el contrario, cuando están cerca de los extremos, hay una variación sustancial en la altura del pico. Entonces, el hecho de que el fondo del valle esté cerca del valor nominal nos asegura que la variación transmitida será lo más pequeña posible. Podemos probar esta característica cambiando el valor nominal de Gradiente. Cuando el nominal es -0,5, el simulador muestra que la DE de la variación del factor aumenta a 4,282, casi un 80% más que para el valor nominal 0. La dependencia de PeakHeight de Col Temp y de Det Wave es lineal. Entonces, independientemente de cómo elijamos los ajustes nominales de estos factores, transmitirán el mismo grado de variación a la salida de altura pico. El experimento nos permite evaluar cómo afectan la robustez, pero no brinda ninguna oportunidad de explotar los resultados para mejorar la robustez.
Figura 8. Perfilador de predicción de altura máxima cuando los factores están en su configuración nominal y la DE natural es 0,4. Para mejorar la legibilidad, las alturas máximas se han dividido entre 1000.
Volviendo a las preguntas originales
Al revisar las preguntas planteadas originalmente, ahora podemos proporcionar las siguientes respuestas:
1. ¿Cuál es la varianza esperada de la predicción de la medición del método para las configuraciones recomendadas del método (la incertidumbre de la medición)?
Respuesta: Examinamos esta pregunta más de cerca para PeakHeight, donde encontramos que la DE es 2970, con contribuciones aproximadamente iguales de la variación entre ejecuciones y de la variación en los factores del proceso de medición.
2. ¿Qué configuración de los factores experimentales logrará un rendimiento aceptable?
Respuesta: Con todos los factores en sus configuraciones nominales (valor codificado en 0), la DE de 2970 es inferior al 1,5 % del tamaño de los valores medidos, lo cual es un nivel aceptable de variación en esta aplicación.
3. ¿Cuáles son los factores que impactan el desempeño del método en una o más respuestas?
Respuesta: Los tres factores con mayor impacto en el rendimiento del método son el perfil de gradiente, la temperatura de la columna y la onda de detección.
4. ¿Podemos hacer que la configuración de los factores experimentales sea robusta para lograr un desempeño que no sea sensible a los cambios en los niveles de los factores?
Respuesta: Vimos que podemos mejorar la robustez de PeakHeight estableciendo el gradiente en su nivel codificado de 0 (el nivel nominal en el experimento). Esa configuración nos ayuda a aprovechar el efecto no lineal del gradiente y reducir la variación transmitida.
5. ¿Podemos evaluar el impacto de la variabilidad de los factores experimentales en el método analítico?
Respuesta: Como señalamos anteriormente, la variabilidad natural de los factores de entrada es responsable de un poco más de la mitad de la variación en la altura máxima.
Envolver
Al revisar las preguntas planteadas originalmente, primero ajustamos un modelo de regresión lineal. Después de darnos cuenta de que existe un efecto no lineal no contabilizado, utilizamos un modelo cuadrático reducido y descubrimos que se ajusta bien a los datos. Al inducir variabilidad en los factores de la cuadrática reducida (perfil de gradiente, temperatura de la columna y onda de detección), pudimos estimar la variabilidad debida al método y evaluar la solidez de la configuración recomendada. La suposición del equipo de que el gradiente es responsable de la no linealidad es claramente importante aquí. Si otros factores también tienen efectos no lineales, podría haber consecuencias sobre cómo mejorar mejor la solidez del método. Exploraremos este tema más a fondo en nuestra próxima publicación de blog.
Notas
[1] Borman, P., Nethercote, P., Chatfield, M., Thompson, D., Truman, K. (2007), Tecnología farmacéutica. http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[2] Kenett, RS y Kenett, DA (2008), Aplicaciones de calidad por diseño en productos tecnológicos biosimilares , Acreditación y garantía de calidad, Springer Verlag, vol. 13, núm. 12, págs. 681-690.
[3] Romero R., Gásquez, D., Sánchez, M., Rodríguez, L. y Bagur, M. (2002), Un enfoque geométrico para las pruebas de robustez en HPLC analítica, LCGC Norteamérica, 20 , págs. 72-80, www.cromatografíaonline.com .
El desarrollo de métodos de medición o análisis va paralelo al desarrollo de productos farmacéuticos.
KPA Group escribió: ¡Gracias por tu comentario, Phil!Grupo KPA escribió:
¡Gracias por tu comentario, Fil!
Phil Borman escribió: Además de las 5 pruebas cromatográficas...Phil Borman escribió:
Además de las 5 respuestas de picos cromatográficos estudiadas, hubiera sido interesante estudiar también la cantidad de cada impureza cuantificada por el método analítico. Esto le daría una indicación real de la solidez, ya que evaluará directamente el impacto en el resultado reportable. Las variaciones en el área y la altura del pico pueden ser irrelevantes si, por ejemplo, las impurezas se cuantifican mediante la normalización con respecto al pico principal (la sustancia farmacológica en la que están presentes).
