QbD 專欄：QbD 是否適用於開發分析方法？編者註：這篇文章是由@ronkenett和@david_s的KPA集團. 它是一系列博客文章的一部分，名為QbD 專欄. 有關作者的更多信息，請單擊上面的作者社區名稱。
Ron Kenett羅恩·肯內特
David Steinberg大衛斯坦伯格
測量或分析方法的開發與藥物產品的開發並行。 對過程監控要求的理解推動了分析方法的性能標準，包括過程關鍵質量屬性 (CQA) 和規格限制。 揭示需要控制以確保安全性或有效性的原料藥的特性決定了 CQAs 的識別。 分析方法的典型要求包括：
- 精確：此要求確保方法可變性僅佔規格範圍的一小部分（規格上限 - 規格下限）。 這也稱為量具再現性和重複性 (GR&R)。
- 選擇性：這決定了在每個生產步驟中監測哪些雜質，並指定了充分區分每種雜質的相對比例的設計方法。
- 靈敏度：為了實現有效的過程控制，這需要能夠準確反映 CQA 變化的方法，這些變化相對於規格限制很重要。
這些標準確立了用於日常操作的方法的可靠性。 這對分析時間、可接受的溶劑和可用設備都有影響。 要開發具有 QbD 原則的分析方法，必須了解該方法的性能標準，以及最終用戶的預期操作意圖。 對一種方法的有限了解可能導致技術從實驗室轉移到商業製造設施或從現有設施轉移到新設施中的效果不佳。 失敗的轉移通常需要大量額外的資源來糾正失敗的原因，通常是在推出新產品面臨巨大壓力的時候。 將質量源於設計 (QbD) 應用於分析方法旨在防止此類問題。 分析方法開發中的 QbD 實施通常是一個四個階段的過程，涉及方法的設計和控制[1] . 階段是：
- 方法設計意圖：識別並指定分析方法的性能。
- 方法設計選擇：選擇實現設計意圖的方法工作條件。
- 方法控制定義：為對性能變化貢獻最大的組件建立和定義適當的控制。
- 方法控制驗證：通過穩健有效的控制展示可接受的方法性能。
測試分析方法的穩健性包括評估操作條件微小變化的影響[2] . 耐用性測試確定在不同的實驗室、分析人員和儀器等各種正常測試條件下對同一樣品進行分析所獲得的測試結果的再現性程度。 在下面的案例研究中，我們專注於使用實驗來評估和提高穩健性。
HPLC 開發案例研究
此處介紹的案例研究來自高效液相色譜 (HPLC) 方法的開發[3] . 這是檢驗分析方法穩健性的典型例子。 特定係統由一台 Agilent 1050、一個可變波長 UV 檢測器和一個 3396-A 型積分器組成。 穩健性研究的目標是找出與標稱操作條件的偏差是否會影響結果。 表 1 列出了本案例研究中使用的因素及其水平。 實驗陣列為 2 7-4具有三個中心點的部分因子實驗（見表 2）。 電平“-1”和“1”對應表1中列出的低電平和高電平，“0”對應標稱電平。 選擇下限和上限以反映正常運行期間標稱設置可能自然發生的變化。 有關部分因子實驗在製劑和藥物產品開發中的 QbD 應用示例，請參閱第二和第三本系列的博客文章。
表格1。 HPLC實驗中的因素和水平。
表 2。 HPLC實驗的實驗陣列。
實驗數組由 11 個實驗遊程組成，這些遊程將設計因子水平組合成一組平衡的組合和三個中心點。
我們可以從 HPLC 實驗中學到什麼
在分析 HPLC 實驗時，我們有以下目標：
- 查找推薦的方法設置（測量不確定度）的預期方法測量預測方差。
- 確定實驗因素的最佳設置以實現可接受的性能。
- 確定影響方法對一個或多個響應的性能的因素。
- 評估實驗因素的可變性對測量響應的影響。
- 通過利用因子效應中的非線性來實現對標稱水平變化不敏感的性能，使 HPLC 過程更加穩健。
如果我們只考慮 2 7-4分數階乘，沒有中心點，我們得到 0.417 的平均預測方差和 100% 的最優擬合一階模型。 這是由於設計的平衡特性（見圖 1 左）。 表 2 中的設計具有三個中心點，減少了區域中心附近的預測不確定性，並且平均預測方差較低，為 0.38。 然而，中心點對斜率的估計沒有貢獻，正如擬合一階模型的較低效率所示（見圖 1 右）。 
圖1。 為沒有（左）和（右）三個中心點的部分階乘設計診斷。
圖 2。 沒有（頂部）和（底部）中心點的預測方差分佈。
圖 2 中的 JMP 預測方差配置文件顯示了在各種因子水平組合下預測方差與誤差方差的比率，也稱為預測的相對方差。 相對方差在設計的中心被最小化。 添加三個中心點可將預測方差降低 25%，從 0.12 降低到 0.09。 這是通過在中心點添加實驗運行而獲得的優勢。 我們稍後將看到的另一個優點是中心點允許我們評估非線性效應，或線性回歸模型的失擬。 第三個優點是中心點為我們提供了系統自然變化程度的無模型估計。 在每個因子水平組合下，實驗產生五個響應：1) 色譜峰面積 (peakArea)，2) 色譜峰高度 (peakHeight)，3) 調整至標準的最小保留時間 (tRmin)，4) 未調整的最小值保留時間 (unad tRmin) 和 5) 色譜分離度 (Res)。 我們在分析數據時首先關注的是確定將因素和響應聯繫起來的適當模型。
我們從分析部分因子實驗的數據中學到了什麼？
線性回歸模型是要考慮的最簡單的模型。 它們代表兩個因素水平之間的響應變化，在我們的例子中，這對應於標記為“-1”和“+1”的水平。 由於我們也有三個中心點，在標記為“0”的水平上，我們還可以評估非線性效應。 我們這樣做，就像在我們的第二篇博客文章中一樣，通過添加一個綜合指標變量來評估失配 (LOF)，該變量在中心點等於“1”，在其他地方等於“0”。 圖 3 顯示了 JMP 效應匯總報告，所有五個響應對所有七個因子和 LOF 指標具有線性效應。 
圖 3。 七個因素的效果總結報告和五個響應的 LOF 指標。
效應匯總表列出了整個五個響應集合中的模型效應，按 p 值升序排序。 每個效果的 LogWorth 定義為 -log10(p-value)，它調整 p-value 以提供適當的圖形比例。 超過 2 的 LogWorth 在 0.01 級別上很重要，因為 -log10(0.01)=2。 該報告包括一個 LogWorth 條形圖，在整數值處有垂直虛線，在 2 處有一條藍色參考線。 顯示的 p 值對應於模型報告的效果檢驗表中顯示的顯著性檢驗。 圖 3 中的報告顯示，總體而言，四個因素和 LOF 在 0.01 水平（Col Temp、Gradient、Buf PH 和 Dim Perc）是顯著的，而 Buf Conc、Det Wave 和 Trie Perc 不顯著。 從表 2 的實驗方案中，可以用線性模型估計 7 個因素和 LOF 指標對 5 個響應的主效應。 圖 4 顯示了調整後 R 的 peakHeight 的參數估計值2 93%，非常合適。 peakHeight 響應對 Col Temp、Det Wave 和 Gradient 的變化最為敏感。
圖 4。 七因素peakHeight的參數估計和線性模型的LOF指標。 為了提高可讀性，peakHeights 除以 1000。
我們觀察到實驗設計中心點的預測值與在那裡實際執行的三個測量值之間存在統計學顯著差異（通過 LOF 變量）。 圖 5 顯示了一個刻畫圖，顯示了每個因素對所有五個響應的線性影響。該圖非常有助於突出顯示哪些條件可能會影響 HPLC 方法。 我們看到 Col Temp 和 Gradient 這兩個最重要的因素會影響幾個不同的響應。Buf pH、Buf Conc 和 Dim Perc 對保留響應的影響特別大，但對其他 CQA 的影響較弱。這些因子很好地擬合了保留響應和 peakHeight，但不適用於 peakArea 或 Res，這反映在這些 CQA 的寬置信帶和方差分析行中整體模型 F 檢驗的高 p 值中的模型輸出。
圖 5。 具有線性模型的 HPLC 實驗分析器。
我們應該如何處理非線性？ 我們的分析發現了 LOF 指標的顯著影響，它指出了圖 5 的刻畫器中未考慮的非線性效應。 我們添加到兩水平部分因子設計的中心點讓我們能夠檢測非線性，但它們沒有提供足夠的信息來確定導致它的原因 - 七個因素中的任何一個（可能是其中幾個）都可能負責對峰高的非線性影響。在我們的下一篇博客中，我們將討論一些設計方案來解決這個問題。 現在，我們展示了我們通過當前實驗取得的成果。 經過多次頭腦風暴後，HPLC 團隊認為梯度很可能是導致非線性的因素。 這個僅基於過程知識的重要假設對我們隨後的所有結論都至關重要。我們繼續將模型擬合到原始實驗數據，其中包括梯度的二次效應。 該團隊還決定只保留每個響應中主效應最強的因子；對於 peakHeight，因素是梯度、柱溫和檢測波長。 在圖 6 中，我們顯示了將這個簡化模型擬合到 peakHeight 響應的參數估計值。 使用此模型，所有項均顯著，調整後的 R 2 89%。在相同的因子設置下估計運行間變化的均方根誤差為 1.754，略小於 peakHeight 本身幅度的 1%（將 peakHeight 除以 1000 後）。
圖 6。 使用二次模型的 peakHeight 的參數估計。 為了提高可讀性，peakHeights 除以 1000。
我們在圖 7 中展示了簡化二次模型的 Profiler。 
圖 7。 HPLC 實驗的 Profiler 與 peakHeight 的簡化二次模型。 為了提高可讀性，peakHeights 除以 1000。
尋找穩健的解決方案
實驗的主要目標之一是評估系統對輸入因子變化的魯棒性。 我們通過將正態噪聲引入簡化二次模型中的四個因素來探索這個問題。 對於這三個因素中的每一個，我們假設標準差為 0.4（以編碼單位表示），這是 JMP 中的默認選項。 這反映了一種觀點，即實驗設置與標稱水平相差約 2.5 SD，因此反映了在實踐中可能遇到的相當極端的偏差。 圖 8 顯示了在中心點設置的噪聲對 peakHeight 的影響，該設置最初被確定為標稱設置。我們可以通過將模擬結果保存到表格並使用 JMP 中的“分佈”選項卡來計算模擬結果的 SD。 SD 結果為 2.397，略大於我們之前計算的 run-to-run SD 1.754。 與分析系統相關的整體 SD 涉及這兩個組件。 要將它們組合起來，我們需要先將它們平方，然後將它們相加（因為方差是相加的，而不是 SD），然後取平方根以返回原始測量尺度。 由此產生的組合 SD 為 2.970，因此因子設置的預期變化導致 SD 比單獨運行間變化的 SD 大 70%。總體 SD 小於 peakHeight 典型值的 1.5%，這對於該過程被認為是可以接受的。
我們的標稱解決方案是否適合穩健性？
圖 8 對回答這個問題很有幫助。 這裡的重要因素是梯度，通過它與 peakHeight 的非線性關係。 該關係的“谷”接近名義選擇 0。 我們對因子變化的模擬生成的梯度值覆蓋了 -1 到 1 的範圍。 當這些值處於谷值時，它們向 peakHeight 傳遞的變化很小。 相比之下，當它們接近極端時，peakHeight 會有很大的變化。 因此，谷底接近標稱設置這一事實向我們保證，傳輸的變化將盡可能小。 我們可以通過改變 Gradient 的標稱值來測試這個特性。 當標稱值為 -0.5 時，模擬器顯示因子變化的 SD 增加到 4.282，比標稱設置為 0 時高出近 80%。 peakHeight 對 Col Temp 和 Det Wave 的依賴性是線性的。 因此，無論我們如何選擇這些因素的標稱設置，它們都會將相同程度的變化傳遞到 peakHeight 輸出。 該實驗讓我們評估它們如何影響穩健性，但沒有提供任何機會來利用結果來提高穩健性。
圖 8。 當因子處於其標稱設置且自然 SD 為 0.4 時，peakHeight 的預測刻畫器。 為了提高可讀性，peakHeights 除以 1000。
回到最初的問題
在回顧最初提出的問題時，我們現在可以提供以下答案：
1. 推薦的方法設置的預期方法測量預測方差是多少（測量不確定度）。
回答：我們最仔細地研究了 peakHeight 的這個問題，我們發現 SD 為 2970，運行間變化和測量過程因素變化的貢獻大致相等。
2. 什麼樣的實驗因素設置可以達到可接受的性能？
回答：在所有因子處於其標稱設置（編碼值為 0）的情況下，2970 的 SD 小於測量值大小的 1.5%，這是該應用中可接受的變化水平。
3. 影響方法在一個或多個響應中的性能的因素是什麼？
回答：對方法性能影響最大的三個因素是梯度曲線、柱溫和檢測波。
4. 我們能否使實驗因素的設置穩健，以實現對因素水平變化不敏感的性能？
回答：我們看到我們可以通過將梯度設置為其編碼級別 0（實驗中的標稱級別）來提高 peakHeight 的魯棒性。 該設置有助於我們利用梯度的非線性效應並減少傳輸的變化。
5. 我們能否評估實驗因素的變異性對分析方法的影響？
回答：正如我們之前提到的，輸入因子的自然變化是導致 peakHeight 變化的原因略多於一半。
包起來
在回顧最初提出的問題時，我們首先擬合線性回歸模型。 在意識到存在無法解釋的非線性效應後，我們使用了一個簡化的二次模型，發現它很好地擬合了數據。 誘導簡化二次因素（梯度曲線、柱溫和檢測波）的變異性，我們可以估計由於方法引起的變異性，並可以評估推薦設置的穩健性。 團隊假設梯度是造成非線性的原因在這裡顯然很重要。 如果其他因素也具有非線性影響，則可能會對如何最好地提高方法的穩健性產生影響。 我們將在下一篇博文中進一步探討這個問題。
筆記
[1]博爾曼，P.， Nethercote, P., 查特菲爾德，M.， 湯普森，D.， Truman, K. (2007)，製藥技術。 http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[2] Kenett, RS 和 Kenett, DA (2008)，質量源於設計在生物仿製藥技術產品中的應用,認證和質量保證，施普林格出版社，卷。 13，第 12 期，第 681-690 頁。
[3]羅梅羅河， 加斯奎茲，D.， 桑謝斯，M.， Rodriguez, L. 和 Bagur, M. (2002)，分析 HPLC 中穩健性測試的幾何方法，LCGC 北美， 20 ，第 72-80 頁， www.chromatographyonline.com .
測量或分析方法的開發與藥物產品的開發並行。
KPA Group 寫道: 感謝您的評論，菲爾！KPA集團寫道：
謝謝你的評論，菲爾！
Phil Borman 寫道: 除了 5 色譜 p...菲爾·博爾曼寫道：
除了研究的 5 個色譜峰響應之外，還應該研究通過分析方法量化的每種雜質的量。 這將為您提供穩健性的真實指示，因為它將直接評估對可報告結果的影響。 例如，如果雜質是通過對主峰（它們所在的原料藥）進行歸一化來量化的，那麼峰面積和峰高的變化可能是無關緊要的。
