QbD 专栏：QbD 是否适用于开发分析方法？编者注：这篇文章是由@ronkenett和@david_s的KPA集团. 它是一系列博客文章的一部分，名为QbD 专栏. 有关作者的更多信息，请单击上面的作者社区名称。
Ron Kenett罗恩·肯内特
David Steinberg大卫斯坦伯格
测量或分析方法的开发与药物产品的开发并行。 对过程监控要求的理解推动了分析方法的性能标准，包括过程关键质量属性 (CQA) 和规格限制。 揭示需要控制以确保安全性或有效性的原料药的特性决定了 CQAs 的识别。 分析方法的典型要求包括：
- 精确：此要求确保方法可变性仅占规格范围的一小部分（规格上限 - 规格下限）。 这也称为量具再现性和重复性 (GR&R)。
- 选择性：这决定了在每个生产步骤中监测哪些杂质，并指定了充分区分每种杂质的相对比例的设计方法。
- 灵敏度：为了实现有效的过程控制，这需要能够准确反映 CQA 变化的方法，这些变化相对于规格限制很重要。
这些标准确立了用于日常操作的方法的可靠性。 这对分析时间、可接受的溶剂和可用设备都有影响。 要开发具有 QbD 原则的分析方法，必须了解该方法的性能标准，以及最终用户的预期操作意图。 对一种方法的有限了解可能导致技术从实验室转移到商业制造设施或从现有设施转移到新设施中的效果不佳。 失败的转移通常需要大量额外的资源来纠正失败的原因，通常是在推出新产品面临巨大压力的时候。 将质量源于设计 (QbD) 应用于分析方法旨在防止此类问题。 分析方法开发中的 QbD 实施通常是一个四个阶段的过程，涉及方法的设计和控制[1] . 阶段是：
- 方法设计意图：识别并指定分析方法的性能。
- 方法设计选择：选择实现设计意图的方法工作条件。
- 方法控制定义：为对性能变化贡献最大的组件建立和定义适当的控制。
- 方法控制验证：通过稳健有效的控制展示可接受的方法性能。
测试分析方法的稳健性涉及评估操作条件微小变化的影响[2] . 耐用性测试确定在不同的实验室、分析人员和仪器等各种正常测试条件下对同一样品进行分析所获得的测试结果的再现性程度。 在下面的案例研究中，我们专注于使用实验来评估和提高稳健性。
HPLC 开发案例研究
此处介绍的案例研究来自高效液相色谱 (HPLC) 方法的开发[3] . 这是检验分析方法稳健性的典型例子。 特定系统由一台 Agilent 1050、一个可变波长 UV 检测器和一个 3396-A 型积分器组成。 稳健性研究的目标是找出与标称操作条件的偏差是否会影响结果。 表 1 列出了本案例研究中使用的因素及其水平。 实验阵列为 2 7-4具有三个中心点的部分因子实验（见表 2）。 电平“-1”和“1”对应表1中列出的低电平和高电平，“0”对应标称电平。 选择下限和上限以反映正常运行期间标称设置可能自然发生的变化。 有关部分因子实验在制剂和药物产品开发中的 QbD 应用示例，请参阅第二和第三本系列的博客文章。
表格1。 HPLC实验中的因素和水平。
表 2。 HPLC实验的实验阵列。
实验数组由 11 个实验游程组成，这些游程将设计因子水平组合成一组平衡的组合和三个中心点。
我们可以从 HPLC 实验中学到什么
在分析 HPLC 实验时，我们有以下目标：
- 查找推荐的方法设置（测量不确定度）的预期方法测量预测方差。
- 确定实验因素的最佳设置以实现可接受的性能。
- 确定影响方法对一个或多个响应的性能的因素。
- 评估实验因素的可变性对测量响应的影响。
- 通过利用因子效应中的非线性来实现对标称水平变化不敏感的性能，使 HPLC 过程更加稳健。
如果我们只考虑 2 7-4分数阶乘，没有中心点，我们得到 0.417 的平均预测方差和 100% 的最优拟合一阶模型。 这是由于设计的平衡特性（见图 1 左）。 表 2 中的设计具有三个中心点，减少了区域中心附近的预测不确定性，并且平均预测方差较低，为 0.38。 然而，中心点对斜率的估计没有贡献，正如拟合一阶模型的较低效率所示（见图 1 右）。 
图1。 为没有（左）和（右）三个中心点的部分阶乘设计诊断。
图 2。 没有（顶部）和（底部）中心点的预测方差分布。
图 2 中的 JMP 预测方差配置文件显示了在各种因子水平组合下预测方差与误差方差的比率，也称为预测的相对方差。 相对方差在设计的中心被最小化。 添加三个中心点可将预测方差降低 25%，从 0.12 降低到 0.09。 这是通过在中心点添加实验运行而获得的优势。 我们稍后将看到的另一个优点是中心点允许我们评估非线性效应，或线性回归模型的失拟。 第三个优点是中心点为我们提供了系统自然变化程度的无模型估计。 在每个因子水平组合下，实验产生五个响应：1) 色谱峰面积 (peakArea)，2) 色谱峰高度 (peakHeight)，3) 调整至标准的最小保留时间 (tRmin)，4) 未调整的最小值保留时间 (unad tRmin) 和 5) 色谱分离度 (Res)。 我们在分析数据时首先关注的是确定将因素和响应联系起来的适当模型。
我们从分析部分因子实验的数据中学到了什么？
线性回归模型是要考虑的最简单的模型。 它们代表两个因素水平之间的响应变化，在我们的例子中，这对应于标记为“-1”和“+1”的水平。 由于我们还有三个中心点，在标记为“0”的水平上，我们还可以评估非线性效应。 我们这样做，就像在我们的第二篇博客文章中一样，通过添加一个综合指标变量来评估失配 (LOF)，该变量在中心点等于“1”，在其他地方等于“0”。 图 3 显示了 JMP 效应汇总报告，所有五个响应对所有七个因子和 LOF 指标具有线性效应。 
图 3。 五个响应的七个因素和 LOF 指标的效果总结报告。
效应汇总表列出了整个五个响应集的模型效应，按 p 值升序排序。 每个效果的 LogWorth 定义为 -log10(p-value)，它调整 p-values 以为图形提供适当的比例。 超过 2 的 LogWorth 在 0.01 级别上很重要，因为 -log10(0.01)=2。 该报告包括一个 LogWorth 条形图，在整数值处有垂直虚线，在 2 处有一条蓝色参考线。 显示的 p 值对应于模型报告的效果检验表中显示的显着性检验。 图 3 中的报告显示，总体而言，四个因素和 LOF 在 0.01 水平（Col Temp、Gradient、Buf PH 和 Dim Perc）是显着的，而 Buf Conc、Det Wave 和 Trie Perc 不显着。 从表 2 的实验方案中，可以用线性模型估计 7 个因素和 LOF 指标对 5 个响应的主效应。 图 4 显示了调整后 R 的 peakHeight 的参数估计值2 93%，非常合适。 peakHeight 响应对 Col Temp、Det Wave 和 Gradient 的变化最为敏感。
图 4。 七因素peakHeight的参数估计和线性模型的LOF指标。 为了提高可读性，peakHeights 除以 1000。
我们观察到实验设计中心点的预测值与在那里实际执行的三个测量值之间存在统计学显着差异（通过 LOF 变量）。 图 5 显示了一个刻画图，显示了每个因素对所有五个响应的线性影响。该图非常有助于突出显示哪些条件可能会影响 HPLC 方法。 我们看到 Col Temp 和 Gradient 这两个最重要的因素会影响几个不同的响应。Buf pH、Buf Conc 和 Dim Perc 对保留响应的影响特别大，但对其他 CQA 的影响较弱。这些因子很好地拟合了保留响应和 peakHeight，但不适用于 peakArea 或 Res，这反映在这些 CQA 的宽置信带和方差分析行中整体模型 F 检验的高 p 值中的模型输出。
图 5。 具有线性模型的 HPLC 实验分析器。
我们应该如何处理非线性？ 我们的分析发现了 LOF 指标的显着影响，它指出了图 5 的刻画器中未考虑的非线性效应。 我们添加到两水平部分因子设计的中心点让我们能够检测非线性，但它们没有提供足够的信息来确定导致它的原因——七个因素中的任何一个（可能是其中几个）都可能导致对峰高的非线性影响。在我们的下一篇博客中，我们将讨论一些设计方案来解决这个问题。 现在，我们展示了我们通过当前实验取得的成果。 经过多次头脑风暴后，HPLC 团队认为梯度很可能是导致非线性的因素。 这个仅基于过程知识的重要假设对我们随后的所有结论都至关重要。我们继续将模型拟合到原始实验数据，其中包括梯度的二次效应。 该团队还决定只保留每个响应中主效应最强的因子；对于 peakHeight，因素是梯度、柱温和检测波长。 在图 6 中，我们显示了将这个简化模型拟合到 peakHeight 响应的参数估计值。 使用此模型，所有项均显着，调整后的 R 2 89%。在相同的因子设置下估计运行间变化的均方根误差为 1.754，略小于 peakHeight 本身幅度的 1%（将 peakHeight 除以 1000 后）。
图 6。 使用二次模型的 peakHeight 的参数估计。 为了提高可读性，peakHeights 除以 1000。
我们在图 7 中展示了简化二次模型的 Profiler。 
图 7。 HPLC 实验的 Profiler 与 peakHeight 的简化二次模型。 为了提高可读性，peakHeights 除以 1000。
寻找稳健的解决方案
实验的主要目标之一是评估系统对输入因子变化的鲁棒性。 我们通过将正态噪声引入简化二次模型中的四个因素来探索这个问题。 对于这三个因素中的每一个，我们假设标准差为 0.4（以编码单位表示），这是 JMP 中的默认选项。 这反映了一种观点，即实验设置与标称水平相差约 2.5 SD，因此反映了在实践中可能遇到的相当极端的偏差。 图 8 显示了在中心点设置的噪声对 peakHeight 的影响，该设置最初被确定为标称设置。我们可以通过将模拟结果保存到表格并使用 JMP 中的“分布”选项卡来计算模拟结果的 SD。 SD 结果为 2.397，略大于我们之前计算的 run-to-run SD 1.754。 与分析系统相关的整体 SD 涉及这两个组件。 要将它们组合起来，我们需要先将它们平方，然后将它们相加（因为方差是相加的，而不是 SD），然后取平方根以返回原始测量尺度。 由此产生的组合 SD 为 2.970，因此因子设置的预期变化导致 SD 比单独运行间变化的 SD 大 70%。总体 SD 小于 peakHeight 典型值的 1.5%，这对于该过程被认为是可以接受的。
我们的标称解决方案是否适合稳健性？
图 8 对回答这个问题很有帮助。 这里的重要因素是梯度，通过它与 peakHeight 的非线性关系。 该关系的“谷”接近名义选择 0。 我们对因子变化的模拟生成的梯度值覆盖了 -1 到 1 的范围。 当这些值处于谷值时，它们向 peakHeight 传递的变化很小。 相比之下，当它们接近极端时，peakHeight 会有很大的变化。 因此，谷底接近标称设置这一事实向我们保证，传输的变化将尽可能小。 我们可以通过改变 Gradient 的标称值来测试这个特性。 当标称值为 -0.5 时，模拟器显示因子变化的 SD 增加到 4.282，比标称设置为 0 时高出近 80%。 peakHeight 对 Col Temp 和 Det Wave 的依赖性是线性的。 因此，无论我们如何选择这些因素的标称设置，它们都会将相同程度的变化传递到 peakHeight 输出。 该实验让我们评估它们如何影响稳健性，但没有提供任何机会来利用结果来提高稳健性。
图 8。 当因子处于其标称设置且自然 SD 为 0.4 时，peakHeight 的预测刻画器。 为了提高可读性，peakHeights 除以 1000。
回到最初的问题
在回顾最初提出的问题时，我们现在可以提供以下答案：
1. 推荐的方法设置的预期方法测量预测方差是多少（测量不确定度）。
回答：我们最仔细地研究了 peakHeight 的这个问题，我们发现 SD 为 2970，运行间变化和测量过程因素变化的贡献大致相等。
2. 什么样的实验因素设置可以达到可接受的性能？
回答：在所有因子处于其标称设置（编码值为 0）的情况下，2970 的 SD 小于测量值大小的 1.5%，这是该应用中可接受的变化水平。
3. 影响方法在一个或多个响应中的性能的因素是什么？
回答：对方法性能影响最大的三个因素是梯度曲线、柱温和检测波。
4. 我们能否使实验因素的设置稳健，以实现对因素水平变化不敏感的性能？
回答：我们看到我们可以通过将梯度设置为其编码级别 0（实验中的标称级别）来提高 peakHeight 的鲁棒性。 该设置有助于我们利用梯度的非线性效应并减少传输的变化。
5. 我们能否评估实验因素的变异性对分析方法的影响？
回答：正如我们前面提到的，输入因子的自然变化是导致 peakHeight 变化的原因略多于一半。
包起来
在回顾最初提出的问题时，我们首先拟合线性回归模型。 在意识到存在无法解释的非线性效应后，我们使用了一个简化的二次模型，发现它很好地拟合了数据。 诱导简化二次因素（梯度曲线、柱温和检测波）的变异性，我们可以估计由于方法引起的变异性，并可以评估推荐设置的稳健性。 团队假设梯度是造成非线性的原因在这里显然很重要。 如果其他因素也具有非线性影响，则可能会对如何最好地提高方法的稳健性产生影响。 我们将在下一篇博文中进一步探讨这个问题。
笔记
[1]博尔曼，P.， Nethercote, P., 查特菲尔德，M.， 汤普森，D.， Truman, K. (2007)，制药技术。 http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[2] Kenett, RS 和 Kenett, DA (2008)，质量源于设计在生物仿制药技术产品中的应用,认证和质量保证，施普林格出版社，卷。 13，第 12 期，第 681-690 页。
[3]罗梅罗河， 加斯奎兹，D.， 桑谢斯，M.， Rodriguez, L. 和 Bagur, M. (2002)，分析 HPLC 中稳健性测试的几何方法，LCGC 北美， 20 ，第 72-80 页， www.chromatographyonline.com .
测量或分析方法的开发与药物产品的开发并行。
KPA Group 写道: 感谢您的评论，菲尔！KPA集团写道：
谢谢你的评论，菲尔！
Phil Borman 写道: 除了 5 色谱 p...菲尔·博尔曼写道：
除了研究的 5 个色谱峰响应之外，还应该研究通过分析方法量化的每种杂质的量。 这将为您提供稳健性的真实指示，因为它将直接评估对可报告结果的影响。 例如，如果杂质是通过对主峰（它们所在的原料药）进行归一化来量化的，那么峰面积和峰高的变化可能是无关紧要的。
