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Con la tecnologia NanoSIMS, gli scienziati ricostruiscono il subcellulare
Le immagini generate da NanoSIMS presso il National Physical Laboratory del Regno Unito vengono ricreate con un software di visualizzazione dei dati in modo che gli scienziati possano esplorare – in dettaglio – regioni analitiche più piccole di una cellula di mammifero. Un'analisi più efficiente aiuta gli scienziati a massimizzare l'impatto scientifico.
Sfida: L'analisi e l'imaging delle cellule utilizzando la spettrometria di massa di imaging multi-isotopo (MIMS) con uno strumento CAMECA NanoSIMS può generare enormi quantità di dati di immagine quantitativi grezzi. La preparazione e l'analisi dei dati richiedono quindi molto tempo.
Soluzione: Il ricercatore Greg McMahon esporta i dati dallo strumento NanoSIMS in JMP, dove utilizza la piattaforma del software Graph Builder con collegamento dinamico per eseguire analisi dei dati statistici ed estrarre dati di immagine per aree di interesse. Con solo una manciata di semplici script, McMahon ha automatizzato le analisi ripetute in modo che ora possa passare dai dati ai risultati in pochi clic.
Risultati: Grazie alla sua capacità di gestire facilmente grandi quantità di dati e di consentire l'esplorazione visiva, McMahon afferma che JMP ha ridotto significativamente i tempi di preparazione e analisi dei dati. Output di dati più riducibili e flussi di lavoro efficienti stanno aiutando NPL e i suoi partner a ottimizzare l'utilizzo dello strumento NanoSIMS e ottenere il massimo impatto scientifico.
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Al centro di tutta la ricerca scientifica c'è la capacità di raccogliere misurazioni accurate e precise. Nel Regno Unito, il National Physical Laboratory (NPL) è un leader di ricerca nella scienza della misurazione, che fornisce soluzioni di misurazione leader a livello mondiale a partner accademici e industriali. Gli esperti di metrologia dell'NPL impiegano tecnologie all'avanguardia per ricerche scientifiche ad ampio raggio, dalla valutazione delle strutture superficiali dei materiali per applicazioni elettroniche al monitoraggio di come le terapie mirate raggiungono le cellule tumorali nel corpo.
Tra i numerosi servizi di ricerca di NPL c'è SIMS, una tecnologia tradizionalmente utilizzata nelle applicazioni di geochimica e semiconduttori per consentire agli scienziati di analizzare la composizione isotopica delle superfici. La tecnica focalizza un fascio di ioni primari sulla superficie di un campione e l'impatto provoca l'espulsione di atomi e molecole dalla superficie del campione, una piccola frazione della quale viene ionizzata nel processo e denominata ioni secondari. In definitiva, gli ioni secondari sono la chiave del passaggio analitico successivo poiché queste particelle cariche possono essere dirette in uno spettrometro di massa e ordinate in base al loro rapporto massa-carica.
Lo spettrometro di massa utilizza un magnete per filtrare gli ioni in base alla loro massa in modo simile a come un prisma è in grado di filtrare la luce nei diversi colori dell'arcobaleno, spiega Greg McMahon, PhD, direttore del laboratorio NanoSIMS di NPL. "Un prisma separa la luce in colori e il magnete in SIMS separa le particelle in base alla loro massa e carica", dice. Questi ioni secondari sono caratteristici della regione da cui sono stati emessi, consentendo così la mappatura e l'imaging delle superfici.
Strumenti ad alta risoluzione consentono l'imaging delle strutture subcellulari
McMahon spiega che il livello successivo della tecnologia SIMS - spettrometria di massa di ioni secondari su nanoscala (NanoSIMS) - ha una risoluzione significativamente più alta rispetto ai SIMS tradizionali e quindi può essere applicato per rispondere a problemi più impegnativi nella biologia unicellulare o subcellulare. Inoltre, è dotato di sette rivelatori separati, il che significa che possono essere rilevati più isotopi emessi all'interno della stessa regione analitica. Gli scienziati possono quindi utilizzare le informazioni provenienti da più isotopi per costruire una mappa più piccola di una cellula di mammifero. Con una risoluzione da lato a lato di 35 nanometri, gli scienziati possono, ad esempio, individuare non solo quale cellula sta assorbendo molecole arricchite isotopicamente, ma anche dove si accumulano all'interno della cellula.
Le applicazioni della tecnologia NanoSIMS sono vaste. Tra questi ci sono il progresso della ricerca farmaceutica e biotecnologica, che è stata un'area di interesse significativa per gli NPL. Oggi, gran parte del lavoro di McMahon prevede la collaborazione con istituzioni e aziende di scienze della vita nel Regno Unito per, ad esempio, affrontare problemi come l'abbandono della droga. “A volte vengono spesi milioni in ricerca e sviluppo per un particolare composto candidato promettente, solo per poi fallire alla fine durante gli studi clinici. Quindi, se deve fallire, è meglio fallire velocemente”, spiega McMahon. "Se possiamo aiutare le aziende farmaceutiche a decidere cosa non funzionerà [in una fase iniziale del ciclo di vita dello sviluppo del farmaco] e farlo rapidamente, possiamo far risparmiare loro un sacco di soldi". Forse ancora più importante, le prime prove che un farmaco candidato fallirà aiuta gli scienziati a reindirizzare le loro risorse e il loro tempo verso altri candidati farmaco più promettenti.
> Maggiori informazioni sulle applicazioni biologiche NanoSIMS nell'articolo di McMahon, " Applicazioni di imaging della spettrometria di massa per imaging multiisotopo (MIMS) ad alta risoluzione nella biologia delle cellule staminali ”, in Protocolli attuali
Ottimizzazione dell'utilizzo di uno strumento scientifico straordinariamente costoso
Per quanto avvincente possa essere la tecnologia NanoSIMS, strumenti come quello di NPL sono rari. L'alto costo della tecnologia la mette fuori dalla portata di molte organizzazioni e nel 2021 ci sono solo circa 40 strumenti NanoSIMS in funzione in tutto il mondo. Per ottenere il massimo impatto scientifico, gli scienziati che lavorano con NanoSIMS sono quindi sotto pressione per ridurre i tempi di sperimentazione e analisi.
McMahon spiega che in NPL, la raccolta dei dati sullo strumento NanoSIMS può in alcuni casi richiedere 18 ore o più per una singola corsa. Tradizionalmente, una regola pratica standard era che il laboratorio poteva aspettarsi di investire il triplo delle ore nell'analisi che nella raccolta dei dati; se un'esecuzione richiedeva 18 ore, l'analisi dei dati potrebbe richiedere più di tre giorni lavorativi. Ma con uno strumento costoso da gestire e mantenere come il CAMECA del laboratorio, il tempo perso per l'analisi significa che è possibile dedicare meno tempo all'utilizzo dello strumento al servizio della scienza.
I dati delle immagini, tuttavia, pongono una serie di sfide uniche. Per uno, spiega McMahon, poiché ogni pixel in un'immagine è significativo, ci sono infinite opportunità per continuare a raccogliere dati sempre più minuti. "Le nostre regioni di interesse iniziano a diventare sempre più piccole e portano ancora dati significativi", afferma; ciò significa set di dati sempre più grandi che possono essere una lotta per il software mal equipaggiato per gestire file di grandi dimensioni.
Per ottimizzare l'utilizzo dello strumento, McMahon ha riconosciuto il potenziale di un software statistico per semplificare sia la sperimentazione che l'analisi che erano state eseguite in precedenza con l'uso di Excel. Anche con la possibilità di codificare macro avanzate di Excel, McMahon afferma che si è perso molto tempo a causa di lunghi passaggi di preparazione dei dati, accesso ai dati, conversione tra formati, analisi ripetute e l'inevitabile risoluzione dei problemi che ne è derivata. Inoltre, ha visto la necessità di visualizzazioni migliori e più interattive con cui identificare più rapidamente i valori anomali nei dati delle immagini.
Un approccio migliore per esplorare i dati dell'immagine
Con la sua combinazione di funzioni di visualizzazione intuitive e capacità per analisi più avanzate, JMP è stata una scelta ovvia. "Quando ho iniziato a utilizzare JMP, era semplicemente 'wow, è fantastico': era facile e ben organizzato e aveva molto senso", spiega McMahon. La capacità di JMP di elaborare set di dati molto grandi è stata un'innovazione particolarmente significativa rispetto ai precedenti approcci standard. E la grafica visiva aiuta a catturare i dati dell'immagine nel suo formato nativo. "Ecco dove penso che JMP eccelle davvero, nelle visualizzazioni che produce", afferma.
Esportando le posizioni e i conteggi dei pixel X e Y dai dati NanoSIMS grezzi direttamente a JMP, McMahon può ricostruire i dati delle immagini in Graph Builder, una piattaforma che supporta anche la manipolazione e l'analisi dei dati. La creazione di sottoinsiemi di dati che rappresentano una singola regione nell'immagine viene eseguita con un clic e la funzione di collegamento dinamico del software consente agli utenti di eseguire un'ampia gamma di analisi, tutte all'interno dello stesso strumento. "Questo rende davvero molto più semplice la parte di esplorazione: se hai la tua immagine costruita in Graph Builder, allora hai una distribuzione delle masse che stai misurando", afferma McMahon.
“Possiamo selezionare i valori anomali [come un cluster con tag isotopico, per esempio] semplicemente osservando dove si trovano nell'immagine. È un modo molto, molto rapido ed efficiente di fare le cose... JMP è davvero flessibile in termini di esplorazione dei dati".
Con solo una piccola quantità di script in JMP, le analisi automatizzate ottengono risultati in "solo un paio di clic"
Dall'introduzione di JMP, McMahon segnala che la sola piattaforma Graph Builder dello strumento ha ridotto significativamente i tempi di analisi e l'automazione ne ha amplificato i vantaggi. La capacità di creare script e di farlo facilmente rende JMP personalizzabile, il che significa che l'aspetto dell'elaborazione dei dati può essere ampiamente automatizzato e farà risparmiare tempo e fornirà output di dati riproducibili. Tutto ciò consente agli scienziati di risolvere i problemi più velocemente.
“Ora abbiamo [l'analisi] automatizzata in una certa misura, in cui eseguiamo solo gli script per la maggior parte del tempo. Quindi sono solo un paio di clic e abbiamo la risposta proprio lì", afferma McMahon. "E la curva di apprendimento per lo scripting in JMP è abbastanza ragionevole, in parte perché JMP ha molte risorse online".
Oltre a fare di più con la personalizzazione, McMahon prevede di utilizzare queste risorse online per esplorare nuovi modi per far funzionare JMP, attraverso la progettazione di esperimenti (DOE) o altre applicazioni di modellazione. Per uno, McMahon suggerisce che un operatore dello strumento potrebbe utilizzare DOE per prevedere l'effetto della modifica di ciascuna delle lenti sullo strumento NanoSIMS e quindi scegliere l'allineamento ottimale dello strumento senza test manuali. Il confronto dei dati predittivi con i dati effettivamente raccolti ha mostrato un'eccellente correlazione.
"Ho effettivamente cambiato alcuni modi in cui gestisco le cose in base ai risultati della progettazione degli esperimenti", afferma. Opportunità di lavorare in modo più efficiente potrebbero significare accelerare il ritmo della scienza ad alto impatto, ed è proprio questo l'obiettivo della scoperta.
