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Con la tecnología NanoSIMS, los científicos reconstruyen el subcelular
Las imágenes generadas por NanoSIMS en el Laboratorio Nacional de Física del Reino Unido se recrean con software de visualización de datos para que los científicos puedan explorar, en detalle, regiones analíticas más pequeñas que una célula de mamífero. Un análisis más eficiente ayuda a los científicos a maximizar el impacto científico.
Desafío: El análisis y la obtención de imágenes de células mediante espectrometría de masas de imágenes multiisotópicas (MIMS) con un instrumento CAMECA NanoSIMS puede generar cantidades masivas de datos de imágenes cuantitativas sin procesar. Por lo tanto, la preparación y el análisis de datos requieren mucho tiempo.
Solución: El científico investigador Greg McMahon exporta datos del instrumento NanoSIMS a JMP, donde utiliza la plataforma Graph Builder del software con enlaces dinámicos para realizar análisis de datos estadísticos y extraer datos de imágenes para áreas de interés. Con solo un puñado de scripts simples, McMahon ha automatizado los análisis repetidos para que ahora pueda pasar de los datos a los resultados con solo unos pocos clics.
Resultados: Con su capacidad tanto para manejar grandes cantidades de datos fácilmente como para permitir la exploración visual, McMahon dice que JMP ha reducido significativamente el tiempo de preparación y análisis de datos. Las salidas de datos más reducibles y los flujos de trabajo eficientes están ayudando a NPL y sus socios a optimizar la utilización del instrumento NanoSIMS y generar el máximo impacto científico.
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En el corazón de toda investigación científica se encuentra la capacidad de recopilar mediciones con precisión y precisión. En el Reino Unido, el Laboratorio Nacional de Física (NPL, por sus siglas en inglés) es un líder en investigación en ciencias de la medición, que brinda soluciones de medición líderes en el mundo a socios académicos e industriales. Los expertos en metrología del NPL implementan tecnología de punta para una amplia investigación científica, desde evaluar las estructuras superficiales de los materiales para aplicaciones electrónicas hasta monitorear cómo las terapias dirigidas alcanzan las células tumorales en el cuerpo.
Entre los muchos servicios de investigación de la NPL se encuentra SIMS, una tecnología utilizada tradicionalmente en aplicaciones de geoquímica y semiconductores para permitir a los científicos analizar la composición isotópica de las superficies. La técnica enfoca un haz de iones primarios en la superficie de una muestra, y el impacto hace que los átomos y las moléculas sean expulsados de esa superficie de la muestra, una pequeña fracción de los cuales se ioniza en el proceso y se denomina iones secundarios. En última instancia, los iones secundarios son la clave para el siguiente paso analítico, ya que estas partículas cargadas pueden dirigirse a un espectrómetro de masas y clasificarse por su relación masa-carga.
El espectrómetro de masas utiliza un imán para filtrar iones por su masa de manera similar a como un prisma puede filtrar la luz en los diferentes colores del arcoíris, explica Greg McMahon, PhD, Director del laboratorio NanoSIMS de NPL. “Un prisma separa la luz en colores y el imán en SIMS separa las partículas por su masa y carga”, dice. Estos iones secundarios son característicos de la región desde la que fueron emitidos, lo que permite el mapeo y la obtención de imágenes de superficies.
Los instrumentos de mayor resolución permiten obtener imágenes de estructuras subcelulares
McMahon explica que el siguiente nivel de la tecnología SIMS, la espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala (NanoSIMS), tiene una resolución significativamente más alta que los SIMS tradicionales y, por lo tanto, se puede aplicar para responder a problemas más desafiantes en biología unicelular o subcelular. Además, está equipado con siete detectores separados, lo que significa que se pueden detectar múltiples isótopos emitidos dentro de la misma región analítica. Luego, los científicos pueden usar información de múltiples isótopos para construir un mapa más pequeño que una célula de mamífero. Con una resolución de lado a lado de 35 nanómetros, los científicos pueden, por ejemplo, identificar no solo qué célula está absorbiendo moléculas enriquecidas isotópicamente, sino también dónde se acumulan esas moléculas dentro de la célula.
Las aplicaciones de la tecnología NanoSIMS son amplias. Entre ellos se encuentran el avance de la investigación farmacéutica y biotecnológica, que ha sido un área importante de enfoque para NPL. Hoy en día, gran parte del trabajo de McMahon implica la colaboración con instituciones y empresas de ciencias de la vida en el Reino Unido para, por ejemplo, abordar problemas como el abandono de medicamentos. “A veces se gastan millones en I+D para un compuesto candidato prometedor en particular, solo para que falle al final durante los ensayos clínicos. Entonces, si se trata de fallar, es mejor fallar rápido”, explica McMahon. “Si podemos ayudar a las compañías farmacéuticas a decidir qué no va a funcionar [en una etapa anterior del ciclo de vida del desarrollo del fármaco] y hacerlo rápidamente, podemos ahorrarles una tonelada de dinero”. Quizás aún más importante, la evidencia temprana de que un candidato a fármaco fallará ayuda a los científicos a redirigir sus recursos y tiempo a otros candidatos a fármacos más prometedores.
> Lea más sobre las aplicaciones biológicas de NanoSIMS en el artículo de McMahon, “ Aplicaciones de imágenes de espectrometría de masas de imágenes de isótopos múltiples de alta resolución (MIMS) en biología de células madre ”, en Protocolos actuales
Optimización de la utilización de un instrumento científico extraordinariamente caro
A pesar de lo convincente que puede ser la tecnología NanoSIMS, los instrumentos como el de NPL son raros. El alto costo de la tecnología la pone fuera del alcance de muchas organizaciones y, a partir de 2021, solo hay unos 40 instrumentos NanoSIMS en funcionamiento en todo el mundo. Para impulsar el máximo impacto científico, los científicos que trabajan con NanoSIMS están bajo presión para acortar los tiempos de experimentación y análisis.
McMahon explica que en NPL, la recopilación de datos en el instrumento NanoSIMS puede, en algunos casos, tomar 18 horas o más para una sola ejecución. Tradicionalmente, una regla general estándar era que el laboratorio podía esperar invertir tres veces más horas en el análisis que en la recopilación de datos; si una ejecución tomó 18 horas, el análisis de datos podría demorar más de tres días hábiles. Pero con un instrumento tan caro de operar y mantener como el CAMECA del laboratorio, el tiempo perdido en el análisis significa que se puede dedicar menos tiempo a operar el instrumento al servicio de la ciencia.
Sin embargo, los datos de imagen plantean una serie de desafíos únicos. Por un lado, explica McMahon, debido a que cada píxel de una imagen es significativo, existen infinitas oportunidades para seguir recopilando datos cada vez más pequeños. “Nuestras regiones de interés comienzan a hacerse más y más pequeñas y aún contienen datos significativos”, dice; eso significa conjuntos de datos cada vez más grandes que pueden ser una lucha para el software mal equipado para manejar archivos de gran tamaño.
Para optimizar la utilización del instrumento, McMahon reconoció el potencial de un software estadístico para agilizar tanto la experimentación como el análisis que anteriormente se había realizado con el uso de Excel. Incluso con la capacidad de codificar macros avanzadas de Excel, McMahon dice que se perdió mucho tiempo en los pasos de preparación de datos que requieren mucho tiempo, el acceso a los datos, la conversión entre formatos, los análisis repetidos y la inevitable solución de problemas que esto conlleva. Además, vio la necesidad de mejores visualizaciones más interactivas con las que identificar más rápidamente los valores atípicos en los datos de imagen.
Un mejor enfoque para explorar datos de imágenes
Con su combinación de funciones de visualización fáciles de usar y capacidades para un análisis más avanzado, JMP fue una opción obvia. “Cuando comencé a usar JMP por primera vez, fue simplemente, 'guau, esto es fantástico': era fácil, estaba bien organizado y tenía mucho sentido”, explica McMahon. La capacidad de JMP para procesar conjuntos de datos muy grandes fue una innovación especialmente significativa en comparación con los enfoques estándar anteriores. Y los gráficos visuales ayudan a capturar datos de imágenes en su formato nativo. “Ahí es donde creo que JMP realmente brilla: en las visualizaciones que produce”, dice.
Al exportar las ubicaciones de los píxeles X e Y y los recuentos de los datos NanoSIMS sin procesar directamente a JMP, McMahon puede reconstruir los datos de la imagen en Graph Builder, una plataforma que también admite la manipulación y el análisis de datos. La creación de subconjuntos de datos que representan una sola región en la imagen se realiza con un solo clic, y la función de vinculación dinámica del software permite a los usuarios realizar una amplia gama de análisis, todo dentro de la misma herramienta. “Eso realmente hace que la parte de exploración sea mucho más fácil: si tiene su imagen construida en Graph Builder, entonces tiene una distribución de las masas que está midiendo”, dice McMahon.
“Podemos seleccionar los valores atípicos [como un grupo etiquetado isotópicamente, por ejemplo] simplemente mirando dónde están ubicados en la imagen. Es una manera muy, muy rápida y eficiente de hacer las cosas... JMP es realmente flexible en términos de exploración de datos”.
Con solo una pequeña cantidad de secuencias de comandos en JMP, los análisis automatizados obtienen resultados en "solo un par de clics".
Desde la introducción de JMP, McMahon informa que la plataforma Graph Builder de la herramienta por sí sola ha reducido significativamente el tiempo de análisis y la automatización ha amplificado los beneficios. La capacidad de crear scripts y hacerlo fácilmente hace que JMP sea personalizable, lo que significa que el aspecto del procesamiento de datos se puede automatizar en gran medida y ahorrará tiempo y proporcionará resultados de datos reproducibles. Todo esto permite a los científicos resolver problemas más rápido.
“Tenemos [el análisis] automatizado en gran medida ahora, donde solo ejecutamos los scripts la mayor parte del tiempo. Así que son solo un par de clics y tenemos la respuesta ahí mismo”, dice McMahon. “Y la curva de aprendizaje para la creación de secuencias de comandos en JMP es bastante razonable, en parte porque JMP tiene muchos recursos en línea”.
Además de hacer más con la personalización, McMahon planea usar esos recursos en línea para explorar nuevas formas de hacer que JMP funcione, ya sea a través del diseño de experimentos (DOE) u otras aplicaciones de modelado. Por un lado, McMahon sugiere que un operador de instrumentos podría usar DOE para predecir el efecto de cambiar cada una de las lentes en el instrumento NanoSIMS y, por lo tanto, elegir la alineación óptima del instrumento sin pruebas manuales. La comparación de los datos predictivos con los datos realmente recopilados mostró una excelente correlación.
“De hecho, he cambiado algunas formas en las que manejo las cosas en función de los resultados del diseño de experimentos”, dice. Las oportunidades para trabajar de manera más eficiente podrían significar acelerar el ritmo de la ciencia de alto impacto, y de eso se trata el descubrimiento.
