RNAi篩選我有一個RNAi資料集，其中包含3個技術重複，並且重複了三次。例如：
運行 1
基因X45
基因X59
基因X51
控制 90
運行 2
基因X 145
基因X159
基因X151
控制 190
運行 3
基因 X 35
基因X 39
基因X 31
控制 50
實際資料集包含數百個基因和數十個對照，每個實驗都有。每次運行的平均值往往會有所不同，但實驗結果相同。我認為這是由於室內濕度造成的，但最終這並不重要。我感興趣的是基因本身，而不是運行差異。我主要想看看哪些基因與對照組有差異，以及機率（p值？）。用JMP分析這些數據的最佳方法是什麼？
品質與工藝工程回复：RNAi 篩選你好@thestrider
我很樂意指導您完成此過程。
我有一些澄清/驗證問題，因為我的最終回應將取決於這些答案。
- 那麼你的數據表看起來像這樣但有很多基因嗎？
- 是否每次運行只有一個對照，但在同一運行中對相同條件進行了三個技術測量（如上表所示）？
- 您是否有類似條件 x 是一種實驗條件，基因 x 具有三個技術重複，並且您有許多實驗條件（條件 x、y、z 等）？
- 您可以提供盡可能多的詳細信息，我的答案/解決方案將更加準確和適當。即使您的數據輸出看起來也有幫助。
謝謝，
回复：RNAi 篩選嗨，克里斯！
你是對的，我的數據集看起來幾乎和你的照片一模一樣，有 400 個基因（基因 x、y、z 等）和一些僅用於驗證的元數據。 （即 96 孔微孔板位置、板名稱等）
每次運行都有許多控制，一些是空載體，（基線，沒有影響）其他是產生高或低響應的已知基因。 每個微孔板都有對照，我們還在三個運行中的每一個中測試了一個僅對照的微孔板。 大約 15% 的數據集（15000 次測量中的約 2000 次）是對照。
- 你有沒有像條件 x 是一種實驗條件，基因 x 有三個技術重複，並且你有很多實驗條件（條件 x、y、z 等）？
我認為這是一個很好的描述方式。 列表中的每個基因都是一個被關閉的基因。 所以我關閉了 400 個基因，一次一個。 在每次運行中，每個微孔板都有三個相同的副本，因此每個基因有 3 個技術重複。 我應該在這裡註意到隨機刪除了大約 15% 的數據（細菌沒有生長、污染等），所以有時基因沒有 3 次技術重複。 然後我以同樣的方式重複了整個實驗兩次。 所以在一個理想的世界裡，我每個條件有 9 個數據點。 審查是隨機的，所以有些基因只有 4-5 個數據點。
空向量控制平均值在所有三個實驗中都不同。 但是每個基因的反應應該是相似的。 因此，一個降低基線值的基因應該總是降低它，但在三個運行中，數字本身有時會發生很大變化。因此，基因 X 在一次運行中的值可能是 70 與 100 的平均基線，但在下一次運行中的值是 120 與基線 300。 我想我可能需要標準化，但我擔心數據可能會拖尾，而且我不確定要這樣做的統計數據。 我正在測量熒光水平，基本上昏暗的東西不會變得更暗，但明亮的東西會變得非常亮。 所以說tailed我的意思是在我剛剛給出的例子中，一個明亮的基因可能是350 vs 100基線，但在下一次運行中它可能是1200 vs 300基線。 換句話說，規模的高端有一個很大的數字範圍，但低端有一個較小的範圍。 我希望這是有道理的。
我附上了一個小幻燈片，它顯示了我正在測量的內容（線蟲線蟲）和數據樣本。
回复：RNAi 篩選謝謝@thestrider ,
是的，這裡有很多事情需要解決。 我無法告訴您應該在統計上做什麼（您需要進行哪些分析或如何解決由於外部因素（例如控制和治療值的轉移）造成的運行之間的差異），因為我們建議不要提供統計建議關於如何處理這些問題中的每一個，但我可以指出 JMP 中的哪些平台可以幫助解決其中的一些問題
無法進行運行內統計比較，因為每次運行只有一個對照，並且無法評估運行內變異的可變性以進行比較（至少不是通過我知道的傳統統計方法）。由於存在三個對照，因此可以估計運行之間的變化，但它會產生偏差，因為您最多可以對感興趣的條件進行 9 個可能的測量。這將被認為是不平衡的，並且可能會給您帶來不等的方差。幸運的是，JMP 有一種方法可以處理 Fit Y by X 平台中的不等方差（Y 中的基因 X 響應，響應部分和 X 中的條件，因子部分）。然後從紅色三角形中選擇 t-Test，這將為您提供每個組的均值和一個 p 值，用於測試條件是否與控制不同，假設方差不等。 刪失數據基本上是缺失數據（由於給出的原因而無法測量），並且您添加技術重複以解決每次運行的此類問題的原因是有道理的。
此外，正如您所提到的，值從一次運行轉移到另一次運行，包括控制，幾乎就像匹配對情況（或配對 t 檢驗之類的情況）或批次效應。 因此，僅憑以上內容還不足以查看是否存在由於這種額外偏差而導致的統計差異。 可以有很多方法來解決這個問題。 一種可能是在運行和條件是效果的情況下進行多元回歸（有點像批處理和條件尋找批處理效果並適應它們）。
在這種情況下，擬合模型是使用和選擇標準最小二乘法的平台，因為個性將使您進入可能最適合您的情況的測試/分析類型。 我會首先通過將運行、條件以及運行和條件的相互作用作為模型效應，然後將基因 X 響應作為 Y 來測試是否存在運行效應。你可以對所有基因都這樣做（對於數百個基因來說，這將是很多事情）。 您擁有的小示例數據，我已經這樣做了，並且由於運行間的可變性肯定會產生影響，因此這意味著必須在您執行的統計測試中考慮它。
我創建了一個 JMP 表，並將按 X 擬合 Y 和擬合模型分析保存到數據表中，這樣您就可以看到我是如何執行每個測試的。 它附在這篇文章中。
最好聯繫內部的統計員，或者看看我們的一位親切的社區成員是否願意就如何最好地處理您的情況提出建議。 也許也可以免費工業問題解決的統計思維課程可能有助於了解有關在這種情況下可能有所幫助的統計數據的更多信息。或者看看統計知識門戶以獲得更多的統計技能提升。
抱歉，我無法提供您可能需要的統計建議，但我希望我至少指出了您可以在 JMP 中分析數據並評估實驗和測試條件重要性的位置。
最好，
回复：RNAi 篩選
@Chris_Kirchberg寫道：
無法進行運行內統計比較，因為每次運行只有一個對照，並且無法評估運行內變異的變異性以進行比較
嗨，克里斯，非常感謝這非常有幫助。 我對這部分有點困惑，抱歉我不清楚，但是我的三個運行中的每一個都有大約 210 個空向量控制數據點。 它們分佈在我所做的每個微孔板上（每次運行 18 個板），但在其他方面是相同的。我還使用已知的高響應和低響應進行了類似數量的控制。
回复：RNAi 篩選你好@thestrider ,
感謝您的澄清。 我以為每次運行每個基因只有一個對照測量。這現在更有意義了。
我認為 400 個基因也分佈在每次運行中使用的 18 個板中嗎？ 每個基因的每個技術重複是否放在不同的平板上？ 所以這意味著每塊板有 11 或 12 個空對照，每塊板測試大約 22 個單獨的基因。 那是對的嗎？
分析這一點的方法取決於實驗的設計和每個技術重複的放置和板上的基因，以及如何使用空（模擬）、低響應和高響應。 如何將正確的變量分配給 JMP 中的正確字段（例如擬合模型、按 Y 擬合 Y，甚至響應篩選）將取決於此。 如何構造數據表也是如此。
由於對照不是基因特異性的，而是一個空/模擬載體對照池，這意味著數據表的結構必須使得每個基因都必須參考相同的對照池。 此外，板之間和運行之間也會有一些標準化。
也許社區或您組織中的某個人可以建議如何規範化這些數據以及如何構建它，以便人們可以使用擬合模型或響應篩選來處理您的數據。 在這種情況下，我可能會使用這兩個平台來分析數據。
抱歉，我無法引導您了解有關如何進行分析的更詳細信息。
最好，
回复：RNAi 篩選僅從實驗設計的角度來看，我想了解最初的問題是。 聽起來您對確定基因相對於對照的反應感興趣。 但是你有多種類型的控件，我不清楚每個控件的目標是什麼。 例如，我可能會從整個平板中減去真正的陰性對照平均值，以減去背景，然後我可能會將平板上的基因標準化為看家基因，以確定基因的信號相對於某些東西是上調還是下調被構成性地表達。 或者可能標準化為最大表達的基因......
這裡的另一個問題是，聽起來 18 個板中的每一個都具有截然不同的動態範圍。 除了噪音之外，重複實驗的動態範圍也相當可觀。
一種方法，我敢肯定會有批評者，是對每個板進行背景減法和歸一化，然後將響應居中並縮放，或將響應縮放到 0-1。這迫使每個板的板動態範圍相同。
既然我們已經解決了這個問題，假設還有一些東西要分析，我們可以查看每個實驗重複中板的基因平均值，然後從實驗重複中取基因的平均值（是的，在中心極限上雙浸定理，及其合法性。）
聽起來您只有 3 或 4 個技術重複，因此估計 sigma 對那個樣本量有點粗略，但我可能會查看 %CV，並設置一些閾值來確定每個基因的數據是否可解釋。
誠然，所有這些建議都是基於不知道您在實驗中做了什麼或做了什麼，甚至不知道實際數據甚至模糊不清。 所以這可能有幫助，或者完全沒用，但希望是前者。
-B
回覆：RNAi篩選首先，非常感謝大家的回复，我對這個社區給予我的所有幫助感到震驚，這太棒了。
@Byron_JMP寫道：
僅從實驗設計的角度來看，我想了解最初的問題是什麼。聽起來你對確定基因相對於對照如何反應很感興趣。但是您有多種類型的控制，而且我不清楚每種控制的目標是什麼。例如，我可以從整個板中減去真正的陰性對照平均值，以減去背景，然後我可以將板上的基因標準化為管家基因，以確定該基因的信號相對於組成性表達的某種物質是上調還是下調。或可能標準化為最大限度表達的基因...
目標是利用螢光報告基因發現對路徑有影響的基因。空向量是我的基線，它顯示了當我不做任何事情時會發生什麼。所以大致類似使用管家基因。陽性和陰性只是為了看看我的 RNA 幹擾是否起作用（誘導特定基因的敲低），並大致了解我的檢測中的螢光範圍。我如何使用 JMP 對空向量進行標準化？我認為這也是有幫助的，很高興聽到您也有同樣的想法。
這裡的另一個問題是，聽起來這 18 個板中的每一個板都有截然不同的動態範圍。除了雜訊之外，重複實驗的動態範圍也相當大。
注意 - 一次運行中的 18 個板的動態範圍沒有太大差異。板塊之間看起來是合理的，而且我也沒有看到板塊位置之間有太大差異。當我重複實驗兩次時（我有 54 個數據板），確實看到了劇烈的動態範圍變化。重複實驗本應是完全相同的，但我認為那天天氣很潮濕。我的記者對氧氣敏感......
一種方法，我相信會受到批評，就是對每個板進行背景減法和標準化，然後對響應進行中心化和縮放，或者將響應縮放到 0-1。這會強制每個板的動態範圍相同。
現在我們已經解決了這個問題，假設還有一些內容需要分析，我們可以查看每個實驗重複中各個平板上的基因平均值，然後取實驗重複中基因的平均值（是的，根據中心極限定理進行雙重浸入，這是合法的。）
這聽起來很有趣，我該如何在 jmp 中做到這一點？
聽起來你只有 3 或 4 個技術重複，因此用這個樣本量估計 sigma 有點粗略，但我可能會查看 %CV，並設定一些閾值來確定每個基因的數據是否可解釋。
我有最多 9 個數據點，其中 1 個點來自三個相同實驗日中的 3 個微孔板（技術重複）。 （生物學重複）對於這種類型的篩選，在我的領域中已經發表了沒有重複的論文。我希望透過至少產生一些重複，我可以在我的資料集中捕獲響應較弱的響應者。如何在 jmp 中設定閾值？
謝謝，這真的很有幫助！
回覆：RNAi篩選你好@thestrider ，
您可能需要在 JMP 中使用列公式（用於建立要分析的標準化資料）和擬合模型（標準最小二乘法，用於定義反應值、模型效應、隨機變數、交互作用等）。如何建立標準化資料的公式以及實驗需要哪些模型效應取決於您（您的統計知識和實驗設計知識）。
以下是本社群網站中分析 96 孔板資料和設計 96 孔板格式實驗的搜尋連結。您可以查看一下，它應該能提供一些指導，幫助您根據具體格式分析您的數據。
此外，還有一些關於使用標準最小二乘法建立列公式和擬合模型的 JMP 文件連結。
我希望這能幫助您找到在 JMP 中執行這些任務的位置。
乾杯，
